猪MEF2A基因的克隆及表达规律的研究

论文摘要

MEF2家族属于MADS超家族,广泛的存在于骨骼肌与心肌细胞中,是最早发现具有肌肉调控特性的DNA结合活性因子。MEF2是肌肉组织发生和发育过程中的重要调控因子,控制脊椎动物肌肉特异基因表达,在肌纤维发育和神经系统发育中都起重要调节作用。基于肌细胞增强子在调控细胞增殖和肌肉分化中的重要作用,进一步揭示其功能和作用机理,有助于更好的理解肌肉组织的发生与发育模式。本研究采用比较基因组学和生物信息学等方法,克隆MEF2A基因并对其结构进行分析;通过构建分子进化树来研究MEF2A基因的系统发育;采用Real time PCR方法,研究了纯种大白猪MEF2A基因不同组织不同发育阶段的表达规律和MEF2家族4个基因的组织表达规律。主要研究结果如下:1.克隆了猪MEF2A基因cDNA序列（Genbank Accession Number:EF576923）,基因编码区全长1524 bp,编码508个氨基酸,分子量为50844.98 Da,其结构上存在一个MADS-box的结构域、位于10-243附近。2.对猪MEF2家族基因的4个基因进行多重序列比对,发现一个极高的同源性区域,此处主要为MADS-box区。4个基因的MADS保守结构域同源比对分析,表明MEF2B与MEF2D的MADS-box结构域的同源性最高为100%,MEF2A与MEF2B和MEF2D的MADS-box结构域分化程度最大,同源性为89%。3.基于猪MEF2A基因的cDNA序列,依据Neighbor-Joining算法,构建了9个物种分子进化关系树。4.采用Real time PCR的方法对90、180、270日龄纯种大白猪的MEF2A基因心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、背肌、腿肌10个组织表达量进行了检测:表明MEF2A基因在肌肉组织中表达量较高且稳定,在其他组织中表达量较低,肝中的表达量最低。5.同样方法对90日龄MEF2家族4个基因进行了10个组织的表达量检测,4个基因组织表达上具有共同特征:肌肉组织（背肌、腿肌、心肌）表达量较高,脏腑肌（胃、大肠、小肠）表达量次之,其他组织中表达量较低;同时,也对同一组织中4个基因的表达情况进行了比较。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 骨骼肌发生和发育过程中的调控因子
• 1.2 骨骼肌发育正调控因子一肌细胞增强因子2（MEF2）
• 1.2.1 MEF2 的概念与结构
• 1.2.2 MEF2 的生理功能
• 1.2.3 MEF2 家族基因的定位与多态性研究
• 1.2.4 MEF2 家族基因表达和激活的调节
• 1.3 实时荧光定量PCR
• 1.3.1 实时荧光定量PCR 检测方式
• 1.3.2 荧光定量PCR 的定量方法
• 1.3.3 2 -△△CT 方法的原理
• 1.3.4 实时荧光定量PCR 技术的应用
• 1.4 本项研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 组织样品
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要药品、试剂及配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 提取
• 2.2.2 RT-PCR 反应
• 2.2.3 引物设计与合成
• 2.2.4 PCR 反应
• 2.2.5 PCR 产物的克隆测序
• 2.2.6 Real Time PCR 反应
• 2.2.7 主要分子生物学软件及统计分析软件
• 2.2.8 相关生物信息学网站
• 3 结果与分析
• 3.1 MEF2A 基因的克隆及生物信息分析
• 3.1.1 MEF2A 基因的克隆
• 3.1.2 MEF2A 的结构、功能分析
• 3.1.3 MEF2A 基因分子进化分析
• 3.2 MEF2A 基因表达规律分析
• 3.2.1 RNA 的质量检测
• 3.2.2 MEF2A 基因组织表达谱
• 3.2.3 MEF2B 基因组织表达谱
• 3.2.4 MEF2C 基因组织表达谱
• 3.2.5 MEF2D 基因组织表达谱
• 3.2.6 定量检测
• 3.2.7 统计分析
• 4 讨论
• 4.1 猪MEF2A 基因的克隆分析
• 4.2 猪MEF2A 基因的进化分析
• 4.3 猪MEF2A 及其家族基因的表达规律分析
• 4.4 关于荧光定量方法的讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文