辽宁海域细菌多样性及刺参养殖水域细菌组成研究

论文摘要

通过构建大连湾（DL17）和辽东湾（ZD-LDW017）两个站点夏季海水的细菌16S rRNA文库及辽东湾和海参养殖池塘秋季海水的细菌16S rRNA文库,利用16S rRNA序列比对法,对四个站点海水细菌多样性进行了分析,为海水微生物资源调查和开发及海参的水产养殖提供有益的信息。结果表明这4个水域的细菌主要为非培养细菌（Uncultured bacterium）。每个海区分别随机选取了200个克隆进行酶切谱型分析和序列测定,共得到180个不同的DNA序列,其中大连湾51个序列,分别属于13种（属）;辽东湾（夏季）53个序列,分别属于13种（属）;辽东湾（秋季）37个序列,分别属于10种（属）;海参池塘海水39个序列,分别属于12种（属）。这4个水域各自有不同的优势菌,在大连湾和辽东湾中没有检测到致病菌,研究结果表明大连湾和辽东湾海水细菌具有丰富的多样性;海参池塘海水中检测到3种与水产养殖相关的致病菌,分别为溶藻弧菌（Vibrio.alginolyticus）、副凝聚短状杆菌（ Brachybacterium qaraconglomeratum）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia菌）,因此控制刺参养殖环境和减少致病菌,对预防和保证刺参养殖生产具有重要作用。自2005年-2006年,连续3次从室内不同养殖时期的刺参附着基上分离优势异养细菌,以期探索刺参附着环境优势异养细菌结构与刺参发病的相关性。每次均分离出6株优势异养细菌,通过进一步对这6种优势菌株群体、个体培养特征观察、生理性状试验和16SrRNA基因序列同源性及系统发育分析表明,菌株0506-1与溶藻弧菌（Vibrio.alginolyticus）具有较高的相似性,菌株0506-2与副凝聚短状杆菌（Brachybacterium qaraconglomeratum）具有较高的相似性,菌株0506-3和0506-4具有相近的亲缘关系,两者均与Nesterenkonia sp.具有较高的相似性,菌株0506-5与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）具有较高的相似性,菌株0506-6与涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia菌）的相似性为99%。经人工感染试验证明,这6株菌对刺参具有不同程度的致病性。药物敏感性试验结果表明,呋南妥因、新霉素和先锋孟多对这6种优势菌株均显示高度敏感性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第1章 综述
• 1.1 大连湾和辽东湾地理位置及海水状况
• 1.1.1 大连湾地理位置及海水状况
• 1.1.2 辽东湾地理位置及海水状况
• 1.2 仿刺参和附着基概述
• 1.2.1 仿刺参
• 1.2.2 附着基
• 1.3 细菌鉴定技术
• 1.3.1 细菌常规鉴定法
• 1.3.2 细菌的数值分类和自动化鉴定
• 1.3.3 化学分类鉴定法
• 1.3.4 16S rRNA 基因技术
• 1.3.5 细菌分类鉴定方法的前景展望
• 1.4 RFLP 技术
• 1.5 克隆技术
• 1.6 聚合酶链式反应（PCR）技术
• 1.6.1 PCR 的基本原理
• 1.6.2 PCR 反应的影响因素
• 1.6.3 PCR 反应固有的偏差
• 1.7 对刺参病害研究的目的和意义
• 第2章 大连湾和辽东湾夏季海水细菌多样性16S rRNA 分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂来源和仪器设备
• 2.2.1 仪器与设备
• 2.2.2 试剂与溶液配制
• 2.2.2.1 主要试剂
• 2.2.2.2 主要溶液的配制
• 2.3 16S rRNA 鉴定的研究方法
• 2.3.1 海水细菌总 DNA 的提取
• 2.3.2 DNA 模板的检测
• 2.3.3 16S rRNA 的 PCR 扩增
• 2.3.4 16S rRNA 的 PCR 产物纯化
• 2.3.5 细菌16S rRNA 的克隆文库构建
• 2.3.6 细菌16S rRNA 克隆文库的覆盖率检测
• 2.3.7 细菌16S rRNA 测序及菌种鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 细菌 DNA 提取和16S rRNA 的扩增
• 2.4.2 细菌16S rRNA 的文库构建及覆盖率
• 2.4.3 海水中细菌16S rRNA 基因序列分析
• 2.5 讨论
• 2.5.1 大连湾和辽东湾中细菌的文库构建
• 2.5.2 大连湾和辽东湾菌群分析
• 2.5.3 16S rRNA 分子生物学鉴定技术
• 第3章 辽东湾和沿岸海参养殖池塘海水细菌的16S rRNA 分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 试剂来源和仪器设备
• 3.3 16S rRNA 鉴定的研究方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 细菌 DNA 提取和16S rRNA 的扩增
• 3.4.2 细菌16S rRNA 的文库构建及覆盖率
• 3.4.3 辽东湾和沿岸海参养殖池塘海水细菌的16S rRNA 基因序列分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 辽东湾和海参养殖池塘中细菌的文库构建
• 3.5.2 海参养殖池塘和辽东湾菌群分析
• 3.5.3 16S rRNA 文库
• 第4章 对刺参附着基优势异养细菌区系与病害发生关系的初步探讨
• 4.1 实验材料
• 4.2 试剂来源及仪器设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 细菌分离和纯化
• 4.3.2 病原菌的超显微观察
• 4.3.3 分离优势细菌的16S rRNA 鉴定
• 4.3.4 致病性实验
• 4.3.5 细菌的生理性状
• 4.3.6 药物敏感试验
• 4.4 结果
• 4.4.1 优势细菌群体和个体的特征观察
• 4.4.2 病原菌的电镜观察
• 4.4.3 16SrRNA 分子生物学测定
• 4.4.4 6 株优势细菌的致病性
• 4.4.5 生理学性状
• 4.4.5.1 温度对优势菌生长的影响
• 4.4.5.2 盐浓度对优势菌生长的影响
• 4.4.5.3 pH 对优势菌生长的影响
• 4.4.6 药物敏感试验
• 4.5 讨论
• 4.5.1 优势菌谱分析
• 4.5.2 致病性及对海参养殖的影响
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附页