鸭瘟强毒dUTPase基因的原核表达及在病毒感染宿主亚细胞定位研究

论文摘要

此文对本研究小组发现的DPV dUTPase基因（GenBank登录号DQ486149）开展了以下系列研究:DPV dUTPase基因序列特征密码子偏爱性分析、克隆、原核表达和抗体制备、在病毒感染宿主鸭胚成纤维细胞中的表达产物亚细胞定位检测、转录和表达时相分析、基于dUTPase蛋白的间接免疫荧光和间接免疫组化检测石蜡切片中DPV方法的建立以及dUTPase在DPV强毒人工感染鸭组织中表达的动态定位监测等,结果如下:1.鸭瘟病毒dUTPase基因序列特征及密码子偏爱性分析DPV dUTPase基因大小为1344bp,编码477aa,包含dUTPase家族蛋白的5个保守motifs（motiflPKRTEDAAYDI、motif2 GRSS、Motif3 GLIDSGYRG、motif4 GDRIAQ、motif5RQFSGFGS）,排列形式3-1-2-4-5具备Ⅱ型dUTPase的典型特征。DPV dUTPase基因在33个疱疹病毒参考株间高度保守,与禽疱疹病毒首先类聚,并与α疱疹病毒的氨基酸同源性较之与β、γ疱疹病毒要高。DPV dUTPase多肽链由61种密码子编码而成,密码子的第三位偏爱于碱基A和T。DPV dUTPase基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用频率比较,差值较大的大肠杆菌有19个,酵母有16个,人有15个。方差分析显示DPV dUTPase基因密码子与酵母差异极显著（r=0.536,P＜0.01）。2.dUTPase基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备通过构建pET-32-DUT重组原核表达载体,利用IPTG进行诱导表达,得到大小约为66kD的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36.2%,主要以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为0.8 mmol/L的IPTG,30℃下诱导4～5h。利用纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清,间接ELISA效价为1:204800。兔抗dUTPase IgG经辛酸-硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化具高效、特异性强的优点。3.DPV体外感染宿主细胞dUTPase基因转录及表达时相分析RNA Dot-blot分析表明,最早可在感染后30min检测到该基因转录产物,随后转录产物量迅速放大,4h达高峰,一直持续到了感染后72h。这种转录谱具有疱疹病毒早期基因的典型特征。以制备的兔抗dUTPase IgG为一抗,对感染鸭瘟强毒的DEF进行Western blot分析,感染后8～72h可检测到观察到与预测大小（约49kD）相一致的单一条带,以感染后12～24h反应条带浓度最大,并一直持续到感染后期。综合分析DPV dUTPase基因的转录表达时相模式,推测该基因为病毒的早期基因,dUTPase的出现及其表达时相可能对晚期蛋白如衣壳蛋白、囊膜糖蛋白等的表达起激活作用,并与病毒的生长周期密切相关。4.DPV dUTPase基因产物在宿主细胞中的表达与亚细胞定位通过细胞免疫荧光进行病毒感染DEF的亚细胞定位检测,结果表明特异性荧光可最早在感染后4h的胞质中检测到,12h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24h后胞核内点状荧光减弱而胞质点状荧光增强;48h胞核和胞质荧光均显著减弱。这种分布特征变化可初步推测为DPV基因组编码的dUTPase在细胞质中完成蛋白质的合成,然后转移至细胞核发挥其基本生物学功能,催化水解脱氧尿苷三磷酸（dUTP）和为DNA的合成提供必需的原料（dTTP）,维持高的dTTP/dUTP比率,阻止尿嘧啶插入到病毒DNA,在DNA合成的高保真度上起监视作用。5.DPV dUTPase在人工感染鸭组织的定位分析用鸭瘟强毒感染成年鸭复制鸭瘟急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肾、胸腺、肠道、法氏囊、脑等组织制作石蜡切片,进行间接免疫荧光和间接免疫组化检测DPV dUTPase在人工感染鸭组织的定位。结果表明:心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、脑、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠扁桃体、哈德氏腺免疫荧光呈阳性或强阳性,气管、肌肉、皮肤呈阴性。最早可在感染后2h检测到少量DPV dUTPase抗原位于大脑、盲肠扁桃体、法氏囊;12h后组织器官中的DPV dUTPase阳性检出率达50%以上,并在感染后4d达最高峰。病毒编码dUTPase主要位于脑神经细胞、肝细胞、免疫器官淋巴巨噬细胞等末端分化细胞中。可见,DPV人工感染鸭后,首先对神经系统和免疫器官进行攻击,然后进一步侵害全身各器官组织。病毒在感染早期大量编码自身dUTPase,可能在一定程度上弥补了感染中后期因组织破坏及细胞功能丧失导致的dUTPase不足,为保证病毒DNA复制的正确性,实现病毒全身各组织泛嗜性感染提供了有力保证。

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本论文的创新性工作

中文摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一部分文献综述及选题目的和意义

第一章病毒脱氧尿苷焦磷酸酶研究进展

1 鸭瘟病毒的分子特征概况

2 病毒脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）研究进展

2.1 脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）的分类及特征分析

2.2 脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）的表达与调控

2.3 脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）的分布与定位

2.4 病毒脱氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase）功能研究概况

2.5 展望

3 选题目的和意义

第二部分试验研究

第二章鸭瘟病毒dUTPase基因序列特征及密码子偏爱性分析

1 数据与方法

1.1 数据

1.2 分析方法

2 结果

2.1 DPV dUTPase基因特征分析

2.2 DPV以及32个疱疹病毒dUTPase基因参考序列密码子使用偏爱分析

2.3 DPV dUTPase基因密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析

2.4 DPV dUTPase基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较

3 讨论

第三章鸭瘟病毒dUTPase基因克隆表达及多克隆抗体的制备

1 数据与方法

1.1 菌株/载体

1.2 实验动物

1.3 主要试剂及配制

1.4 主要仪器设备

1.5 其它

2 实验方法

2.1 PCR扩增鸭瘟病毒CHv株dUTPase基因

2.2 dUTPase基因的T-载体克隆与鉴定

2.3 表达载体的构建

2.4 重组蛋白的诱导表达及条件优化

2.5 重组蛋白的纯化

2.6 兔高免血清的制备

2.7 ELISA检测兔抗dUTPase抗体效价

2.8 兔抗dUTPase IgG的纯化及鉴定

3 结果

3.1 鸭瘟病毒dUTPase基因的扩增

3.2 dUTPase基因的T-克隆与鉴定

3.3 重组表达质粒pET-32-DUT的构建

3.4 重组蛋白的诱导表达及条件优化

3.5 重组蛋白的纯化

3.6 免疫兔血清的Western-blot检测

3.7 兔抗dUTPase血清ELISA效价的检测

3.8 兔抗dUTPase IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定

4 讨论

4.1 基因表达引物的设计

4.2 诱导表达

4.3 抗血清的制备及纯化

第四章鸭瘟强毒体外感染宿主细胞dUTPase基因转录及表达时相分析

1 材料

1.1 菌株/毒株/细胞

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

1.4 其它

2 实验方法

2.1 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞dUTPase基因的转录时相分析

2.2 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞dUTPase基因的表达时相分析

3 结果

3.1 DPV dUTPase基因在宿主细胞的转录时相分析

3.2 DPV dUTPase基因产物在宿主细胞的表达时相分析

4 讨论

4.1 关于Dot-blot转录时相分析

4.2 关于Western-blot表达时相分析

第五章鸭瘟强毒dUTPase基因产物在宿主细胞中的表达与亚细胞定位

1 材料

1.1 毒株/细胞

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 间接免疫荧光检测DPV dUTPase亚细胞定位方法的建立及优化

2.2 DPV dUTPase基因产物亚细胞定位的动态监测

3 结果

3.1 间接免疫荧光检测DPV dUTPase亚细胞定位方法的建立及优化

3.2 DPV dUTPase基因产物亚细胞定位的动态监测

4 讨论

4.1 关于蛋白定位研究的方法

4.2 病毒dUTPase感染宿主亚细胞的定位分析

4.3 关于DPV dUTPase在宿主亚细胞定位的时相分析

4.4 DPV dUTPase宿主亚细胞定位与病毒增殖相关性的初步探讨

第六章鸭瘟强毒dUTPase基因产物在人工感染鸭组织中的表达与定位分布

1 材料

1.1 毒株/试验动物

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 人工感染动物试验

2.2 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV dUTPase方法的建立与优化

2.3 免疫酶组织化学检测DPV dUTPase组织定位方法的建立及优化

3 结果

3.1 人工感染鸭瘟强毒后鸭的临床症状及大体解剖病理变化

3.2 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV dUTPase在鸭组织的定位

3.3 间接免疫组化检测石蜡切片中DPV dUTPase在鸭组织的定位

4 讨论

4.1 间接免疫荧光和间接免疫组化方法的建立与优化

4.2 不同方法检测DPV dUTPase在人工感染鸭体内表达及分布规律比较

4.3 DPV dUTPase在人工感染鸭体内组织分布检测意义的初步探讨

4.4 DPV dUTPase在鸭体内组织亚细胞定位与病毒基因功能相关性初探

4.5 DPV dUTPase在鸭体内组织细胞嗜性与基因功能相关性初探

第三部分结论

第四部分参考文献

附录

致谢

作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文

鸭瘟强毒dUTPase基因的原核表达及在病毒感染宿主亚细胞定位研究

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