杂色云芝漆酶同工酶基因的克隆及高效表达

论文摘要

采用基因工程技术提高漆酶产量和改善其酶学特性是降低漆酶使用成本和提高酶解效率的有效途径。论文以杂色云芝为出发菌株,克隆、表达和改造了漆酶基因,并建立了适宜的表达条件。主要研究结果如下：（1）通过RT-PCR克隆出两个漆酶基因lccl和lcc2。其中lccl基因全长1,497 bp,lcc2基因全长1,515 bp。lccl和lcc2氨基酸水平同源性为76.59%。（2）成功构建了漆酶毕赤酵母基因工程菌KM71H/lcc1和KM71H/lcc2。最高表达水平分别达到530 U/L、580 U/L。酶学性质研究表明,lccl最适温度为50℃,lcc2最适温度为60℃,二者在30℃、40℃、50℃时稳定性都较好；二者最适pH都为2.0,pH稳定性较好。（3）对重组酵母KM71H/lcc1在摇瓶中单因素诱导条件的研究结果表明,适宜的培养基初始pH为7.5,Cu2+浓度为0.5 mmol/L,甲醇添加量为1.0%,摇床转速为210r/min。同时,低温诱导及添加适量的蛋白胨和酪氨酸均有利于目的蛋白的分泌。采用响应面的方法对重组毕赤酵母产漆酶影响最大的3个因素进行优化,最佳组合条件为培养基初始pH7.0,甲醇添加量0.6%,Cu2+浓度0.5 mmol/L,优化后的酶活最高可达到2093U/L,为单因素优化的一倍。（4）以工业基础盐为培养基,控制温度为28℃、pH为6.0、溶氧为20%-40%,进行了高密度发酵,得到最高酶活为4100 U/L。（5）结合lcc2序列特点,定点突变了Asp208Asn,当以愈创木酚为底物时,突变后的最适pH变为5.0,向碱性方向偏移了0.5个单位；将lcc2双碱性氨基酸K196R197分别突变为R196K197和G196R197时,改造后的表达量并未提高,说明对lcc2而言,单独突变蛋白酶降解位点并不是提高酶活力的有效途径；优化了lcc2基因中五组连续稀有密码子,且漆酶的表达量与优化前相比有所提高；以酿酒酵母α因子信号肽和漆酶自身信号肽分别引导漆酶分泌表达时,酿酒酵母α因子信号肽作用效果比漆酶自身信号肽要好；成功地将SV40增强子添加到酿酒酵母α因子信号肽之前,但重组毕赤酵母并没有表达产漆酶。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 课题研究的背景及意义
• 2. 本论文主要研究内容
• 3. 本论文创新之处
• 第一章 绪论
• 1.1 漆酶的来源
• 1.2 漆酶的化学组成
• 1.3 漆酶的结构及催化机制
• 1.3.1 漆酶的结构
• 1.3.2 漆酶的催化机制
• 1.4 漆酶的酶学性质
• 1.5 漆酶及其基因的研究进展
• 1.5.1 漆酶基因的克隆及异源表达
• 1.5.2 漆酶基因的改造
• 1.6 漆酶的应用
• 1.6.1 在造纸工业中的应用
• 1.6.2 在环境保护中的应用
• 1.6.3 在生物检测中的应用
• 1.6.4 在食品工业中的应用
• 第二章 杂色云芝漆酶基因的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 药品与酶
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 引物设计
• 2.1.5 培养基与主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 杂色云芝总RNA的提取
• 2.2.2 将mRNA反转录为cDNA一链
• 2.2.3 漆酶基因的克隆
• 2.2.4 琼脂糖凝胶核酸电泳
• 2.2.5 目的片段的回收
• 2.2.6 DNA浓缩
• 2.2.7 PCR产物的TA克隆
• 2.2.8 重组质粒转化大肠杆菌
• 2.2.9 质粒小量提取
• 2.2.10 重组质粒的PCR验证
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 全序列获得
• 2.3.3 阳性克隆子的筛选与鉴定
• 2.3.4 核苷酸序列及同源性分析
• 2.4 小结
• 第三章 漆酶基因在毕赤酵母中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 药品与酶
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 引物设计
• 3.1.5 培养基及主要试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 目的基因的PCR扩增
• 3.2.2 PCR扩增产物的割胶回收
• 3.2.3 PCR扩增产物的双酶切
• 3.2.4 表达载体的双酶切
• 3.2.5 连接
• 3.2.6 感受态细胞TOP10F’的制备与转化
• 3.2.7 阳性质粒的筛选
• 3.2.8 重组质粒的大量提取
• 3.2.9 重组质粒的线性化
• 3.2.10 酵母菌株KM71H感受态细胞的制备
• 3.2.11 毕赤酵母的电击转化
• 3.2.12 酵母重组子的筛选
• 3.2.13 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达
• 3.2.14 毕赤酵母工程菌蛋白的SDS-PAGE电泳
• 3.2.15 毕赤酵母工程菌蛋白的Native-PAGE电泳
• 3.2.16 漆酶活力测定
• 3.2.17 酶学性质
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 漆酶基因的PCR扩增
• 3.3.2 漆酶基因及表达载体的双酶切
• 3.3.3 漆酶基因与表达载体的连接和阳性表达质粒的筛选
• 3.3.4 重组质粒的大量提取及表达载体线性化
• 3.3.5 酵母的电击转化
• 3.3.6 重组酵母阳性筛选
• 3.3.7 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达
• 3.2.8 毕赤酵母工程菌蛋白的电泳
• 3.3.9 酶学性质
• 3.4 小结
• 第四章 重组毕赤酵母漆酶表达条件的优化及高密度发酵
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试菌种
• 4.1.2 药品与酶
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 培养基及主要试剂配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 单因素对表达的影响
• 4.2.2 多因素对表达的影响
• 4.2.3 高密度发酵产漆酶
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 单因素对表达的影响
• 4.3.2 多因素对表达的影响
• 4.3.3 高密度发酵的结果
• 4.4 小结
• 第五章 漆酶基因的定点突变
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株及质粒
• 5.1.2 药品与酶
• 5.1.3 引物设计
• 5.1.4 培养基及主要试剂配制
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 改造依据
• 5.2.2 定点突变
• 5.2.3 突变后的重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 N208突变结果
• 5.3.2 蛋白酶水解位点改造结果
• 5.3.3 密码子优化结果
• 5.3.4 不同信号肽结果
• 5.3.5 添加增强子结果
• 5.4 小结
• 第六章 结果与讨论
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 详细摘要
• Abstract