古菌RNA聚合酶组装及启动子元件分析

论文摘要

本研究利用嗜热表达载体pSeSD在冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus）中同源表达了RNA聚合酶亚基RpoL,采用Ni柱共纯化和凝胶过滤层析纯化到了多个蛋白质组分,通过质谱验证为RNA聚合酶复合体。同时本研究通过利用2M/4M/6MUrea和1M/2M/3MNaCl处理纯化到的RNAP复合体,初步研究了RNA聚合酶亚基间的相互作用关系。结果表明RpoL与RpoB", RpoA’和RpoA"之间的相互作用较其它亚基更强。根据该结果可推测在硫化叶菌中RNA聚合酶亚基的组装过程可能有别于真核生物,首先形成L-B"-A’-A"平台,其他亚基再结合该平台形成完整的RNA聚合酶复合体。另外,我们还在大肠杆菌中表达了硫化叶菌通用转录因子TBP和TFB1。本文在EMSA试验中利用上述纯化的RNA聚合酶和TBP、TFB1研究了硫化叶菌转录机器与araS基本启动子和杂合启动子（T6BRE）的相互作用,结果表明转录机器与杂合启动子（T6BRE）结合较强,与araS启动子有微弱结合。该结果在体外实验中证实了araS基本启动子不能启动转录的原因是由弱BRE造成的。本研究还在硫化叶菌表达载体pSeSD的基础上,构建了串联纯化标签表达载体pSeSH以及双宿主表达载体pT7SH。串联纯化标签表达载体pSeSH能够有助于提高共纯化蛋白的特异性,双宿主表达载体pT7SH能在大肠杆菌和硫化叶菌中分别利用T7启动子和araS启动子控制目的蛋白表达。本研究还利用报告基因系统分析了单链结合蛋白基因（ssb）的启动子,研究结果表明,尽管BRE位点存在缺陷,ssb基本启动子仍然具有很高活性。因此我们推测可能存在一个下游激活元件增强ssb启动子活性。最后,本研究利用微生物蛋白跨细胞膜转运的原理,在极端嗜热硫化叶菌中构建蛋白跨膜转运体系。我们将硫化叶菌胞外蛋白a-Amylase作为运载蛋白,将其基因克隆到硫化叶菌表达载体pSeSD上,构建成跨膜转运载体,并以lacS为报告基因,验证了该蛋白跨膜转运体系的可行性。综上所述,本研究为进一步分析硫化叶菌RNA聚合酶亚基组装模式、ssb启动子下游激活元件以及共纯化法鉴定硫化叶菌蛋白质相互作用打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 古菌
• 1.2 硫化叶菌
• 1.3 古菌启动子的主要元件
• 1.4 古菌RNA聚合酶
• 1.5 古菌通用转录因子
• 1.6 古菌遗传操作体系
• 1.7 蛋白跨膜转运与蛋白质耐热性改造
• 1.8 研究目的及内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基成分及培养条件
• 2.1.3 主要分子生物学试剂和由公司完成的实验
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法及原理
• 2.2.1 大肠杆菌DH5a感受态制备和热激转化法
• 2.2.2 硫化叶菌感受态的制备和电击转化法
• 2.2.3 提取硫化叶菌总DNA
• 2.2.4 硫化叶菌RNAP和GTFs表达载体的构建
• 2.2.5 RNAP和GTFs的表达与纯化
• 2.2.6 包涵体蛋白的复性纯化
• 2.2.7 SDS-PAGE和Western Blot
• 2.2.8 电泳迁移率变动实验（EMSAs）
• 2.2.9 双宿主表达载体pT7SH的构建
• 2.2.10 硫化叶菌ssb基因启动子缺失突变报告质粒的构建
• 2.2.11 β-Galactosidase（LacS）酶活分析
• 2.2.12 MALDI-TOF鉴定
• 2.2.13 跨膜转运表达载体和报告质粒的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 古菌RNA聚合酶组装及T6BRE/araS启动子元件分析
• 3.1.1 基本转录因子（GTFs）的表达纯化
• 3.1.1.1 TBP的表达纯化
• 3.1.1.2 TFB1的表达纯化
• 3.1.2 RNA聚合酶亚基同源表达及互作分析
• 3.1.2.1 RNAP复合体纯化
• 3.1.2.2 RNA聚合酶亚基间相互作用的分析
• 3.1.3 GTFs和RNAP与硫化叶菌启动子序列互作分析
• 3.2 嗜热古菌表达载体的改进及ssb基因启动子的分析
• 3.2.1 串联纯化标签表达载体的改进及应用
• 3.2.2 双宿主表达载体的构建
• 3.2.3 ssb启动子突变株的电转化及菌株酶活测定
• 3.3 利用嗜热古菌表达系统改造酶的耐热特性
• 3.3.1 跨膜转运表达载体的构建
• 3.3.2 lacS基因为报告基因验证该系统的可行性
• 4 讨论
• 4.1 古菌RNA聚合酶组装及T6BRE/araS启动子元件分析
• 4.2 嗜热古菌表达载体的改进及ssb基因启动子的分析
• 4.3 利用嗜热古菌表达系统改造酶的耐热特性
• 参考文献
• 附录
• 致谢