LCM纯化的NPC与正常鼻咽粘膜上皮细胞的比较蛋白质组学研究

论文摘要

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方地区（广东、广西、湖南、福建、江西）常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界首位,是一种中国特色癌,严重危害国人的生命和健康。虽然目前的研究结果认为NPC的发病与EB病毒感染、遗传因素和环境因素有关,但NPC的发病机制仍然不清楚,亦无有效的NPC分子标志物。发现新的NPC分子标志物将有助于NPC的诊断、治疗和发病机制研究。高通量的组学技术具有发现肿瘤相关分子的潜能。如cDNA芯片分析NPC的基因表达谱已发现一些可能与NPC发病有关的异常表达基因。蛋白质是细胞的功能分子,蛋白质组学技术在临床应用方面被认为优于cDNA芯片技术,它在识别与肿瘤发生发展相关的蛋白质、发现肿瘤分子标志物和治疗靶标方面具有独特的优势。肿瘤组织与其起源的正常组织的比较蛋白质组学研究是发现肿瘤标志物和治疗靶标的最直接和合理的方式之一。然而,采用组织样本进行蛋白质组学研究的主要障碍是组织的异质性。组织异质性问题在NPC尤为明显,因为NPC组织样本常常含有大量的浸润性淋巴细胞和其他间质细胞,NPC起源的正常鼻咽粘膜上皮细胞在鼻咽粘膜上皮组织（normal nasopharyngal epithelial tissue,NNET）样本中所占比例也不到10%,导致活检组织中常常不含目的细胞。因此,为提高比较蛋白质组学研究筛选肿瘤分子标志物的准确性,有必要纯化靶细胞用于蛋白质组学研究。从肿瘤组织中纯化细胞的方法有许多种,如激光捕获显微切割（laser capture microdissction,LCM）、组织原代培养和流式细胞术分选等。LCM技术是目前从组织中纯化细胞的最好方法之一,已有采用LCM技术从乳腺癌、肝癌和胰腺癌等肿瘤组织中纯化靶细胞用于蛋白质组学研究的报道。为筛选NPC相关的蛋白质,本研究采用LCM技术分别从新鲜的活检NPC组织和NNET样本中切割纯化相应的NPC癌细胞及其正常鼻咽粘膜上皮细胞,应用二维凝胶电泳（two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE）技术分离LCM纯化细胞的总蛋白质,图像分析识别NPC组织和NNET的差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离串联质谱（ESI-Q-TOF-MS）鉴定差异表达的蛋白质,采用Western blotting和组织芯片（tissue microarray,TMA）免疫组化技术对部分差异蛋白的表达水平进行验证。为探讨NPC差异表达蛋白质的功能和临床病理学意义,采用免疫组化染色检测部分差异蛋白质在存档石蜡包埋组织（30例NNET、98例原发NPC及20例颈淋巴结转移NPC）中的表达,统计学分析差异蛋白质表达水平与临床病理特征和患者预后的关系。采用Westernblotting检测部分差异蛋白质在不同分化程度或转移潜能的4株NPC细胞系中的表达,采用RNA干扰（RNAi）和体外侵袭实验检测差异蛋白质cathepsin D的表达水平对NPC细胞侵袭能力的影响。研究结果如下:（一）筛选NPC差异表达的蛋白质采用LCM技术从NPC组织和NNET中分离纯化NPC癌细胞和正常鼻咽粘膜上皮细胞;应用2-DE技术建立了分辨率高、重复性好的LCM纯化的NPC细胞和正常鼻咽粘膜上皮细胞的2-DE图谱;图像分析识别了49个在NPC和NNET中差异表达的蛋白质点,采用MALDI-TOF-MS和ESI-Q-TOF-MS鉴定了36个在NPC和NNET中差异表达的蛋白质。其中20个蛋白质包括stathmin,metastasisinhibition factor nm23,heat shock protein 27,tubulin,vimentin,enolase,voltage-dependent anion channel 2和guanine nucleotide binding protein等只在NPC细胞中表达或表达明显增高,16个蛋白质包括calcyphosine,annexin A1,14-3-3α,squamous cell carcinoma antigen 1（SCCA 1）,cytokeratin8（CK8）,aldehyde dehydrognase,and cathepsin D等在NPC细胞中表达下调或缺失。Western blotting和TMA免疫组化染色检测5个差异蛋白质（stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ、cytokeratin8和cathepsin D）在NPC组织和NNET中的表达水平,其结果与蛋白质组学研究结果一致,说明LCM结合蛋白质组学技术筛选到的NPC差异表达蛋白质可靠。（二）NPC差异表达蛋白质的临床病理学意义1、stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D与NPC分化、临床分期、转移和复发的关系:采用免疫组织化学方法检测4个差异蛋白质（stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D）在98例NPC（WHOtypeⅠ:5例,WHO typeⅡ:13例,WHO typeⅢ:80例）、30例NNET及20例颈淋巴结转移NPC组织中的表达水平。结果显示:①14-3-3σ和annexinⅠ在NPC组织中的表达较NNET明显下调（p＜0.05）,在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显下调（p＜0.01）;②cathepsin D在NPC组织中的表达较NNET明显下调（p＜0.05）,cathepsin D在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显上调（p＜0.01）;③stathmin在NPC组织中的表达较NNET明显上调,在颈淋巴结转移NPC中的表达与原发NPC无明显差异。统计学分析结果显示:①stathmin上调和14-3-3σ、annexinⅠ下调与差的NPC组织学分化、进展的NPC临床分期和NPC复发相关（p＜0.01）;②14-3-3σ和annexinⅠ下调与NPC淋巴结和远处转移相关（p＜0.01）;③cathepsinD下调与差的NPC组织学分化相关,而cathepsin D上调与进展的NPC临床分期、NPC的复发、淋巴结和远处转移相关（p＜0.01）。2、stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D与NPC细胞系分化程度和转移潜能的关系:采用Western blotting检测4个差异蛋白质（stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ、和cathepsin D）在高分化NPC细胞系CNE1、低分化NPC细胞系CNE2、高转移NPC细胞系5-8F和无转移潜能NPC细胞系6-10B中的表达。结果显示:①stathmin在CNE2中的表达水平明显高于CNE1,在5-8F和6-10B中的表达水平无明显差异;②14-3-3σ和annexinⅠ在CNE2中的表达水平明显低于CNE1,在6-10B中的表达水平明显高于5-8F;③cathepsin D在CNE2中的表达水平明显低于CNE1,在6-10B中的表达明显低于5-8F。结果表明:stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D与NPC细胞株的分化程度和/或转移潜能有关。3、cathepsin D表达水平对NPC细胞体外侵袭能力的影响:采用RNAi技术和体外侵袭实验检测cathepsin D表达水平下调对NPC细胞系5-8F侵袭能力的影响。结果显示:下调cathepsin D表达水平能降低NPC细胞的侵袭能力,cathepsin D表达水平与NPC侵袭能力呈正相关。4、差异表达蛋白质与NPC预后的关系:基于stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D在原发NPC中的表达水平,采用统计学方法和Kaplan-Meier生存曲线分析4个差异蛋白质表达水平与NPC病人预后的关系。结果显示:stathmin和cathepsin D高表达、14-3-3σ和annexinⅠ低表达的NPC病人预后较差;多因素分析结果提示:stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D的表达水平是一个独立的预后因子。本研究采用LCM结合蛋白质组学技术从NPC和NNET中筛选到36个差异表达的蛋白质,对其中4个差异表达蛋白质（stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D）的临床病理学意义进行分析表明:stathmin、14-3-3σ、annexinⅠ和cathepsin D与NPC的分化程度、转移和预后相关,有望成为预测NPC转移、预后和区别NPC分化程度的分子标志物。本文研究结果在鉴别NPC组织学分化程度、预测NPC病人预后及预警NPC转移和复发方面有一定的临床价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词简表
• 第一章: LCM结合蛋白质组学技术筛选NPC差异表达蛋白质
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章: 差异表达蛋白质与NPC临床病理特征及预后的关系
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果