论文摘要
本论文通过扩大培养杜氏盐藻藻种进行研究。实验准确的记录了盐藻的生长周期并绘制成生长曲线，六个藻种细胞生长速度差异不大，均在大约140h后进入对数生长期，约210h后进入稳定期，这和其他报道一致。对六种盐藻的生化指标进行研究，结果表明：所研究的6种杜氏盐藻均含大量营养元素，Dunaliella parva油脂含量高达细胞干重的44.30％，Dunaliella salina油脂含量为细胞干重的12.47％。叶绿素的含量在19.7μg／ml到29.2μg／ml之间。同时采用3，5-2硝基水杨酸法测定杜氏盐藻细胞中的多糖含量，在对蛋白质含量的测定上与以往采用了同样的Bradford法，但对样品的处理方式不同，本研究直接以离心收集的湿藻细胞进行，迄今为止还没有这方面的报道。由于盐藻总脂含量较高，结合目前的研究热点：生物柴油，实验首次从D.salina中克隆了乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylase，ACCase，EC 6.4.1.2）的Beta亚基。乙酰辅酶A羧化酶属于生物素包含酶（biotincontaining enzyme）的类型Ⅰ（typeⅠ）。乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）具有催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A的羧化作用，是在脂肪酸合成和代谢中起重要作用的中间代谢物。ACCase包括不同的形式，被不同的基因编码，本试验选择油脂含量最少，但目前研究的最多的藻种Dunaliella salina进行乙酰辅酶A羧化酶Beta亚基的克隆。根据真核生物NP045833.1（chloroplast Chlorella vulgaris）、YP635822.1（chloroplast Oltmannsiellopsis viridis）、YP636254.1（chloroplast Pseudendoclonium akinetum）以及YP635920.1（plastid Helicosporidium sp.ex Simulium jonesii）等的ACCβ基因的氨基酸高度保守序列，设计一对简并引物，利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）细胞的总RNA，通过RT-PCR，得到的一段长为400bp左右的cDNA片段，该片段与其他物种的ACCB基因具有很高的相似性。在此基础上进行5’和3’RACE扩增盐藻ACCβ基因的末端，得到全长为1288bp的盐藻ACCβ基因，产物与T载体连接后转化至大肠杆菌Top10中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果表明在盐藻中所获得的该cDNA片段，核苷酸长度为1288bp，编码349个氨基酸，genebank登录号分别为EF363909，ABO33321.1，推导的氨基酸序列与下列物种的ACCβ基因进行同源性比较：NP045833.1（chloroplast Chlorella vulgaris）为84％、YP635822.1（chloroplast Oltmannsiellopsis viridis）为82％、YP636254.1（chloroplast Pseudendoclonium akinetum）为80％。乙酰辅酶A羧化酶是一多亚基的酶，本实验成功克隆的Beta亚基，对以后的研究奠定了坚实的基础。