产甲壳素酶菌株HD001的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶学性质研究

论文摘要

甲壳素是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的多糖,是多数真菌细胞壁、无脊椎动物、甲壳类动物外骨骼以及昆虫体表和昆虫中肠围食膜的主要结构成分,是自然界多糖生物合成量仅次于纤维素的第二大天然资源,其降解产物具有多种用途。甲壳素酶能够催化水解N-乙酰-D-葡萄糖胺糖苷键,降解甲壳素得到几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖。甲壳素酶广泛存在于植物、动物及微生物细胞和组织中,从微生物中筛选产甲壳素酶菌株,并进行酶的研究,不仅具有一定的学术价值,而且对于自然资源利用、生物防治、环境保护、食品、医药等领域的发展都具有重要的实际意义。本研究以筛选高产甲壳素酶菌株为目的,从海洋泥样中分离、筛选出一株产甲壳素酶的菌株,命名为HD001,该菌在以胶体甲壳素为唯一碳源的平板上能产生较高活性的甲壳素酶。通过对菌株HD001的发酵条件研究,确定了其产甲壳素酶最适培养基组分为（w/v）:（NH4）2SO4 2.0%、NaCl 0.5%、K2HPO4 0.07%、KH2PO4 0.03%、MgSO4·7H2O 0.05%、葡萄糖0.1%、酵母粉0.3%、胶体甲壳素1.5%;最适产酶培养条件为:培养基起始pH值6.0,接种量1.0%（v/v）,以500ml三角瓶装瓶量为150ml,培养温度30℃,160r/min摇瓶培养120h,发酵液酶活力可达1.7U/mL。在优化条件下发酵培养菌株HD001,发酵液冷冻离心,上清液采用30%90%硫酸铵分级盐析、透析、冷冻干燥后制得甲壳素酶粗酶,粗酶经DEAE-纤维素离子交换层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化,制得电泳纯的甲壳素酶,酶纯化倍数为11.98,收率为28.1%。SDS-PAGE电泳显示单一条带,其相对分子质量约为85.7kDa。对甲壳素酶进行酶学性质的研究,结果表明该甲壳素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.6;酶活力在pH 5.57.0时相对稳定;25℃放置24h酶活力基本不变。Mg2+对酶的活性有促进作用,Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Mn2+等离子对酶活力均有不同程度的抑制,以Mn2+最为明显。该酶的米氏常数Km为1.931mg/mL,最大反应速率Vmax为2.381μmol/min·mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 绪论
• 1.1 甲壳素
• 1.2 甲壳素的降解
• 1.2.1 化学法降解甲壳素
• 1.2.2 物理法降解甲壳素
• 1.2.3 酶法降解甲壳素
• 1.3 甲壳素酶
• 1.3.1 甲壳素酶的来源
• 1.3.2 甲壳素酶的分类及作用机制
• 1.3.3 甲壳素酶结构与功能关系
• 1.3.4 甲壳素酶的性质
• 1.3.5 甲壳素酶基因工程研究进展
• 1.4 甲壳素酶研究的一般方法
• 1.4.1 甲壳素酶产生菌的筛选
• 1.4.2 甲壳素酶活力的测定
• 1.4.3 甲壳素酶的分离纯化
• 1.5 甲壳素酶的应用
• 1.5.1 甲壳素酶在植物病害控制中的应用
• 1.5.2 甲壳素酶在医学真菌学中的应用
• 1.5.3 水解甲壳素制备几丁寡糖
• 1.5.4 降解甲壳素保护生态环境
• 1.6 甲壳素酶研究的前景展望
• 2 产甲壳素酶菌株的分离与筛选
• 2.1 材料及试剂
• 2.1.1 实验药品
• 2.1.2 主要设备
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 取样
• 2.2.2 菌种的初筛
• 2.2.3 菌株的复筛
• 2.2.4 菌种的保藏
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 菌种的初筛
• 2.3.2 菌株摇瓶复筛结果
• 2.4 小结
• 2.4.1 产甲壳素酶菌株的筛选
• 2.4.2 甲壳素酶活力的测定
• 3 产甲壳素酶菌株HD001 发酵条件研究
• 3.1 材料及试剂
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 实验药品
• 3.1.3 主要设备
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 发酵液酶活力的测定
• 3.2.2 菌株HD001 生长曲线的测定
• 3.2.3 菌株HD001 发酵培养条件研究
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 菌株HD001 生长曲线的测定
• 3.3.2 菌株HD001 发酵培养条件研究
• 3.3 小结
• 3.3.1 产甲壳素酶菌株HD001 的最适碳源
• 3.3.2 产甲壳素酶菌株HD001 的最适氮源
• 3.3.3 产甲壳素酶菌株HD001 的最适培养条件
• 4 甲壳素酶的分离纯化
• 4.1 材料及试剂
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验药品
• 4.1.3 主要设备
• 4.1.4 发酵培养基
• 4.1.5 试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌株HD001 发酵液的制备
• 4.2.2 胞内酶的提取
• 4.2.3 甲壳素酶粗酶的制备
• 4.2.4 蛋白质含量的测定
• 4.2.5 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• 4.2.6 Sephacryl S-100 凝胶过滤柱层析
• 4.2.7 甲壳素酶纯度鉴定及分子量的测定
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 胞内酶的提取
• 4.3.2 甲壳素酶粗酶的制备
• 4.3.3 DEAE-纤维素离子交换柱层析
• 4.3.4 Sephacryl S-100 凝胶过滤柱层析
• 4.3.5 甲壳素酶纯化结果
• 4.3.6 甲壳素酶纯度鉴定及分子量的测定
• 4.4 小结
• 4.4.1 甲壳素酶粗酶的制备
• 4.4.2 甲壳素酶的分离纯化
• 4.4.3 甲壳素酶分子量的测定
• 5 甲壳素酶酶学性质的研究
• 5.1 材料及试剂
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验药品
• 5.1.3 主要设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 甲壳素酶液的配制
• 5.2.2 甲壳素酶活力的测定
• 5.2.3 温度对甲壳素酶活性的影响
• 5.2.4 pH 值对甲壳素酶活性的影响
• 5.2.5 金属离子对甲壳素酶活性的影响
• 5.2.6 底物浓度对甲壳素酶活性的影响
• 5.2.7 甲壳素酶动力学研究
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 温度对甲壳素酶活性的影响
• 5.3.2 pH 值对甲壳素酶活性的影响
• 5.3.3 金属离子对甲壳素酶活性的影响
• 5.3.4 底物浓度对甲壳素酶活性的影响
• 5.3.5 甲壳素酶动力学研究
• 5.4 小结
• 5.4.1 甲壳素酶的最适反应温度
• 5.4.2 甲壳素酶的最适反应pH 值
• 5.4.3 金属离子对甲壳素酶活性的影响
• 总结
• 1. 产甲壳素酶菌株的筛选和发酵条件优化
• 2. 甲壳素酶的分离纯化
• 3. 甲壳素酶酶学性质研究
• 研究展望
• 参考文献
• 致谢