大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究

论文摘要

以大米蛋白为原料研究抗氧化肽的制备技术及其性能。采用酶水解大米蛋白的方法生产高活性的抗氧化肽。以酶解液对DPPH自由基清除率为考察指标,从七种商品蛋白酶中筛选出三种蛋白酶:风味酶、中性酶、木瓜蛋白酶;分别进行正交试验,得出三种酶在各自最佳作用条件下对DPPH自由基清除率分别为75.2%、89.5%和58.8%;大米抗氧化肽的EC50值分别为2.92 mg/mL、2.17 mg/mL和3.86 mg/mL。在各自最佳反应条件下得到的三种酶的水解产物,进行DPPH自由基清除率和EC50值的横向比较,最终确定中性蛋白酶为本试验用酶,其最佳制备工艺参数为,底物浓度10g/100ml,加酶量8%,酶解pH 6.0,酶解温度60℃,时间30min。在大米蛋白单酶水解实验基础上,将选出的三种酶两两组合,进行双酶分步水解试验,发现加酶顺序对水解产物的抗氧化活性有较大的影响;同时第一步酶解后灭酶明显优于不灭酶。最终比较得到最优组合:大米蛋白先经中性酶水解30min,灭酶后再由木瓜酶水解15min,得到的酶水解产物EC50为1.23mg/mL,与单酶相比下降了43.3%。在超声功率1500W、超声初始温度40℃条件下超声处理大米蛋白溶液20min,再用中性酶水解制备抗氧化肽,其DPPH自由基清除率可达到74.8%,EC50为0.932 mg/mL。超声处理原料使水解产物的EC50值比没做处理的显著下降了57.1%。研究了制备得到多肽的抗氧化性能试验,发现大米抗氧化肽具有较强的清除O2。-、DPPH自由基、羟自由基,其EC50分别为0.0678 mg/mL、0.932 mg/mL和0.117mg/mL。以732阳离子交换树脂、SepHadex-G25和HPLC制备柱纯化大米抗氧化肽,最终研究得到两种抗氧化肽。使用美国ABI的串联飞行质谱仪4700 TOF/TOF对分离到的抗氧化肽进行结构分析,得到两个多肽序列分别为Gly-Val-Pro-Ser-Ala-Val-Ser-Arg-Asn-Met-Thr-Arg-Ser-Arg和Leu-Ala-Ser-Gln-His-Leu-Val-Ala-Ile-Leu-Asp-Pro-Pro-Arg,其EC50值分别为:4.91μM和5.39μM。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 大米蛋白质的研究概况
• 1.1.1 大米蛋白质的概述
• 1.1.2 大米浓缩蛋白（RPC）和分离蛋白（RPI）
• 1.1.3 大米改性蛋白
• 1.1.4 抗性蛋白
• 1.2 生物功能肽的研究概述
• 1.2.1 生物功能肽概述
• 1.2.2 生物功能肽
• 1.2.3 食品感官肽
• 1.2.4 生物活性肽的开发现状
• 1.3 生物抗氧化剂的研究概述
• 1.3.1 生物抗氧化剂对人类健康的作用
• 1.3.2 生物抗氧化剂分类和作用
• 1.3.3 植物来源抗氧化剂
• 1.3.4 微量元素类抗氧化剂
• 1.3.5 蛋白质、多肽、氨基酸类抗氧化剂
• 1.4 超声波技术在酶水解过程的应用研究
• 1.4.1 超声波及其在食品工程方面的应用
• 1.4.2 超声波对酶促反应过程的影响
• 1.4.3 超声波对酶作用的机理
• 1.5 本研究的立题依据、意义及内容
• 1.5.1 立题依据和研究意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 大米蛋白酶解最佳蛋白酶的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 试验材料与仪器设备
• 2.2.1 主要材料与试剂
• 2.2.2 主要仪器与设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 试验原料中各主要成分的测定
• 2.3.2 蛋白酶活力、水解度和DPPH自由基清除率的测定方法
• 2.4 最佳蛋白酶筛选试验
• 2.4.1 最佳水解用酶的初选试验
• 2.4.2 单因素试验
• 2.4.3 交优化试验
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 试验原料的成份的测定
• 2.5.2 蛋白酶活力
• 2.5.3 蛋白酶的初选试验
• 2.5.4 三种较优蛋白酶的进一步筛选
• 2.6 本章小结
• 参考文献
• 第三章 大米蛋白双酶分步水解研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与设备
• 3.2.1 主要材料与试剂
• 3.2.2 主要仪器与设备
• 3.3 研究方法
• 3.3.1 清除DPPH自由基的测定方法
• 3.3.2 中性酶对大米蛋白的风味酶水解产物的进一步水解作用
• 3.3.3 风味酶对大米蛋白的中性酶水解产物的进一步水解作用
• 3.3.4 木瓜酶对大米蛋白的风味酶水解产物的进一步水解作用
• 3.3.5 风味酶对大米蛋白的木瓜酶水解产物的进一步水解作用
• 3.3.6 中性酶对大米蛋白的木瓜酶水解产物的进一步水解作用
• 3.3.7 木瓜酶对大米蛋白的中性酶水解产物的进一步水解作用
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 大米蛋白采用风味酶和中性酶分步酶解
• 3.4.2 大米蛋白采用中性酶和风味酶分步水解
• 3.4.3 大米蛋白采用风味酶和木瓜酶分步水解
• 3.4.4 味酶对大米蛋白的木瓜酶水解产物的继续水解
• 3.4.5 中性酶对大米蛋白的木瓜酶水解产物的继续水解
• 3.4.6 木瓜酶对大米蛋白的中性酶水解产物的继续水解
• 3.4.7 不同双酶水解产物清除DPPH自由基能力比较
• 3.5 本章小节
• 参考文献
• 第四章 大米蛋白超声处理及其酶解产物抗氧化研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与设备
• 4.2.1 主要材料与试剂
• 4.2.2 主要仪器与设备
• 4.3 研究方法
• 4.3.1 超声处理对大米蛋白酶水解过程影响的预备试验
• 4.3.2 超声波预处理大米蛋白对酶解过程的影响
• 4.3.3 大米蛋白酶解产物的抗氧化性能试验
• 4.4 实验结果与分析
• 4.4.1 超声波处理对酶水解过程的预备试验
• 4.4.2 超声波处理大米蛋白的单因素实验分析
• 4.4.3 超声波处理大米蛋白的中心组合设计实验分析
• 4.4.4 大米抗氧化肽抗氧化试验分析
• 4.5 本章小节
• 参考文献
• 第五章 大米抗氧化肽的分离纯化与结构表征
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要材料与试剂
• 5.2.2 主要仪器与设备
• 5.3 研究方法
• 5.3.1 试验中测定的指标
• 5.3.2 超滤过程的研究
• 5.3.3 732阳离子交换分离纯化抗氧化肽
• 5.3.4 Sephadex G-25凝胶过滤纯化抗氧化肽
• 5.3.5 RP-HPLC纯化抗氧化肽
• 5.3.6 抗氧化肽的质谱分析
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 超滤过程参数的研究结果
• 5.4.2 料液温度对超滤膜的膜通量影响
• 5.4.3 超滤液特性的试验结果
• 5.4.4 离子交换法分离大米抗氧化肽研究
• 5.4.5 Sephadex-G25进一步分离纯化大米降血压肽
• 5.4.6 RP-HPLC纯化大米抗氧化肽结果
• 5.4.7 抗氧化肽的质谱分析结果
• 5.5 本章小节
• 参考文献
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 研究创新点
• 6.3 工作展望
• 致谢
• 攻读博士学位期间论文发表情况