视黄醛膜蛋白的质子泵功能及其光响应器件材料的研究

论文摘要

细菌视紫红质(BR)和古紫质4(AR4)是科学家们在盐湖中生长的嗜盐菌细胞膜上发现的奇特蛋白质。这类分子结构中带有视黄醛色素团的蛋白质具有光化学循环和跨膜质子定向传递功能的独特性质引起了许多科学工作者的兴趣,并基于其特性提出了“蛋白质计算机”的设想。在过去的三十多年里,对于这个蛋白质的研究和探索从来没有间断过,使其成为被研究最多的蛋白质之一。对于视黄醛膜蛋白的研究可分为两个主要方向:一个是结构和机理的基础研究,一个是其独特的功能的应用开发研究。视黄醛膜蛋白分子是世界上最小的能量转换器,其经过千百万年进化而成的精密结构与其独特功能之间的关联机理吸引着很多研究者投入其中。而这类蛋白质独到的优于现有无机有机光致折变和光致变色材料的功能,相比于大部分活性蛋白质高度稳定的结构使其在光电和光色方面具有应用潜力。本人博士课题的研究对象就是具有的细菌视紫红质(BR)和古紫质4(AR4)及其相关突变体,主要研究了这些视黄醛膜蛋白的质子泵动力学和热力学问题以及BR和AR4在脂质体上自组装的取向行为。初步探讨了应用于图像探测和光信息接受等领域的模型器件的材料制备技术。本课题涉及到了高分子材料科学、生命科学以及信息科学等不同领域,各种知识学科的交叉为研究方向带来了全新的视角和方法,也带来了新的技术难题。本论文的主要创造性工作为:1.建立了利用瞬态光照产生的光电信号的pH敏感性探测视黄醛蛋白质的质子释放基团(PRC)在受激状态下的pK_a的光电法测量手段。通过质子泵与光循环关联的简化模型,首次推导了用以描述视黄醛蛋白质(包括BR,AR4和突变体D96N)在光照激发后质子释放和提取导致的质子流的动力学方程。建立了一个全新的光电法来检测视黄醛蛋白质光照激发后质子泵功能导致的质子浓度变化,并用此方法结合上述动力学方程得到了研究质子泵机理重要的参数。通过这些参数在不同pH条件下的变化情况,得以准确的测定视黄醛蛋白质质子释放基团(PRC)在激发状态下的pK_a。与传统的染料法相比,光电法最大的优势在于可以检测复杂条件下特别是可以在缓冲体系中测到信号,用此方法发现了一些缓冲分子以及冠醚的存在会降低视黄醛蛋白质激发状态PRC的pK_a。描述质子泵质子流的理论公式的推导以及高效检测质子流信号的光电法的建立组成了一个完整的研究视黄醛蛋白质质子泵机理的平台和工具,不论是对已有蛋白质的功能进一步深入研究还是对突变体蛋白质未知功能的检测对比都是重要和有效的手段,是质子泵机理研究的有力工具。2.发展了基于视黄醛蛋白质的光电器件和光色器件的新的材料制备方法。(1)首次制备了各个像素分离的视黄醛蛋白质的光电响应微阵列。通过结合基因工程定点突变、光刻技术、电沉积技术和化学偶联技术制备了一种新型的具有光信息接受功能的微米级蛋白质功能芯片,且具有高稳定性、单点单控的特点,可以应用于图像探测和光信息接受等领域,为视黄醛蛋白质在光电应用领域的进一步发展提供了硬件上的解决方案。(2)提出了新型的可用于光色信息存储的视黄醛蛋白质膜材的制备方法以及材料的进一步封装方法,改进了材料的光学性能和稳定性,也为材料的器件标准化提出了可行的方案。3.探讨了作为一种膜蛋白的视黄醛蛋白质的自组装行为。将蛋白质定向自组装与磷脂脂质体中,发现AR4自组装进脂质体的行为与BR具有相同的特点;并初步考察了PEG化对蛋白质性质和自组装取向的影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 介绍
• 1.2.1 盐湖与嗜盐菌
• 1.2.2 细菌视紫红质（BR）和古紫质4蛋白（AR4）
• 1.3 研究进展
• 1.3.1 细菌视紫红质的质子泵机理
• 1.3.2 细菌视紫红质的技术应用
• 1.3.3 近5年BR在Science和Nature上的文章
• 参考文献
• 第二章 光电法检测视黄醛蛋白质的质子泵功能
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 公式推导
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 普通电解质溶液
• 2.4.2 含有冠醚的电解质溶液
• 2.4.3 含有缓冲分子的电解质溶液
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 信号产生的原理
• a时的优势'>2.5.2 光电法在检测视蛋白受激发时PRC的pK_a时的优势
• a的因素'>2.5.3 影响pK_a的因素
• 2.6 本章小结
• 参考文献
• 第三章 基于视黄醛蛋白质微阵列技术的光感受器件的制备
• 3.1 前言
• 3.1.1 背景介绍
• 3.1.2 方法介绍
• 3.2 实验与结果
• 3.2.1 药品
• 3.2.2 基因工程
• 3.2.3 蛋白质提取和活性检测
• 3.2.4 金电极微阵列制备
• 3.2.5 蛋白质膜制备
• 3.2.6 光响应检测
• 3.3 结论
• 参考文献
• 第四章 视蛋白光色存储膜的制备和封装
• 4.1 前言
• 4.2 方法与材料
• 4.2.1 所用材料
• 4.2.2 交联复合膜制备
• 4.2.3 材料的封装
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 M态衰减动力学光谱
• 4.3.2 可视化记录
• 4.4 小结与展望
• 参考文献
• 第五章 细菌视紫红质的PEG化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料与仪器
• 5.2.2 PEG活化
• 5.2.3 偶联结果
• 5.2.4 分离方法讨论
• 5.2.5 基因工程突变K159D
• 5.3 PEG化对BR蛋白质的影响
• 5.3.1 稳定性的影响
• 5.3.2 光循环和质子泵功能的影响
• 5.4 含PEG化BR脂质体
• 参考文献
• 第六章 含视蛋白脂质体的制备及检测
• 6.1 前言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 材料与仪器
• 6.2.2 含蛋白脂质体的制备
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 形态检测
• 6.3.2 光循环功能检测
• 6.3.3 脂质体外介质的酸碱变化检测
• 6.3.4 取向检测
• 6.4 其它工作——BR的DPPC脂质体的初步研究
• 6.4.1 BR的DPPC脂质体的制备
• 6.4.2 中性和酸性条件下制备的BR/DPPC脂质体的光学响应
• 6.4.3 变温实验
• 6.4.3.1 中性条件制备的正常取向脂质体的变温实验
• 6.4.3.2 酸性条件下制备的反向脂质体的变温实验
• 6.4.4 讨论
• 6.4.4.1 BR与AR4的自组装
• 6.4.4.2 酸碱性调节取向
• 6.4.4.3 温度影响
• 6.5 结论
• 参考文献
• 第七章 全文总结
• 7.1 论文的创新方面
• 7.2 论文的理论和实际意义
• 7.3 论文需要改进的方面
• 附录
• 附1.嗜盐菌的培养和bR蛋白的提取、纯化
• 附2.动力学光谱仪以及本人对于仪器的改造
• 附3.质子泵活性的检测方法
• 附4.BR在金表面的直接组装
• 附5.PEG化蛋白质的凝胶电泳
• 附6.二十种氨基酸分类表以及AR4与BR的氨基酸序列比较
• 作者简历和发表论文目录
• 致谢