苹果α-法尼烯合成酶基因表达载体的构建及遗传转化

论文摘要

虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害之一,这种生理病害不仅影响果实的食用品质特别是外观品质,降低其商品价值,而且使果实抗病性降低,易感染病菌而腐烂,从而造成巨大的经济损失。实验证明α-法尼烯是诱导虎皮病发生的重要因素。果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,调控此途径的酶包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）,法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）,α-法尼烯合成酶（AFS）。其中AFS是调控α-法尼烯合成的最直接的限速酶,它催化法尼基焦磷酸（FPP）转变为α-法尼烯。我们可以通过基因敲除方法调控此基因的表达,从而调控α-法尼烯的合成。根据α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,构建正义和RNAi载体,转化烟草和苹果,研究α-法尼烯的表达情况;研究影响苹果离体叶片的再生因子,完善苹果再生体系;利用根癌农杆菌介导,转化苹果,筛选苹果新品种。主要结果如下:1.利用RT-PCR方法,从苹果果皮中克隆苹果α-法尼烯合成酶基因（AFS）。2.构建了pBI-AFS正义表达载体,并转化烟草,得到转AFS基因的烟草。3.利用构建pET-AFS原核表达载体,转化大肠杆菌,制备抗体,western杂交结果显示该基因在烟草中成功表达。4.构建α-法尼烯合成酶基因RNAi表达载体,进行苹果的遗传转化。5.通过研究基本培养基、激素配比、蔗糖浓度等对苹果离体叶片再生不定芽的影响,优化再生条件,完善苹果再生体系。6.在建立高效的苹果再生体系基础上,研究了苹果转化过程中的影响因子,初步建立了苹果的遗传转化系统。

论文目录

• 英文缩写符号及中英文对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 虎皮病的研究进展
• 1.2 α-法尼烯的合成途径及α-法尼烯合成酶研究进展
• 1.3 RNAi 的研究进展
• 1.3.1 RNAi 的作用机制
• 1.3.2 RNAi 的应用
• 1.4 苹果再生体系及转基因的研究进展
• 1.4.1 苹果离体再生的研究进展
• 1.4.1.1 基因型差异
• 1.4.1.2 培养条件差异
• 1.4.2 苹果转基因的研究进展
• 1.4.2.1 外植体
• 1.4.2.2 选择标记基因
• 1.4.2.3 导入的外源基因
• 1.5 研究目的意义及前景展望
• 1.5.1 研究目的意义
• 1.5.2 前景展望
• 第一部分 基因克隆及转α-法尼烯合成酶的基因烟草研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 酶及生化试剂
• 1.1.3 PCR 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 RNA 的提取方法
• 1.2.1.1 RNA 的提取
• 1.2.1.2 配制药品
• 1.2.2 RNA 电泳
• 1.2.2.1 药品配制
• 1.2.2.2 凝胶的制备
• 1.2.3 RNA 反转录
• 1.2.4 苹果α-法尼烯合成酶基因扩增
• 1.2.4.1 PCR 扩增
• 1.2.4.2 连接反应
• 1.2.4.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.4.4 转化及克隆筛选
• 1.2.4.5 碱法小量提取质粒DNA
• 1.2.4.6 酶切鉴定
• 1.2.5 植物表达载体的构建
• 1.2.5.1 碱法大量提取质粒DNA
• 1.2.5.2 正义表达载体构建
• 1.2.5.3 RNAi 表达载体构建
• 1.2.6 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备及转化
• 1.2.6.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.6.2 冻融法转化农杆菌
• 1.2.7 转基因烟草的PCR 检测
• 1.2.7.1 CTAB 法微量法提取基因组DNA
• 1.2.7.2 转基因植株的PCR 筛选
• 1.2.7.3 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 1.2.7.4 RNA 反转录
• 1.2.7.5 PCR 检测
• 1.2.8 转基因烟草的western 检测
• 1.2.8.1 原核表达载体构建
• 1.2.8.1.1 AFS 编码区基因的克隆
• 1.2.8.1.2 表达载体构建
• 1.2.8.1.3 AFS 原核表达的诱导
• 1.2.8.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.8.2 抗体的制备
• 1.2.8.3 抗血清效价的测定（试管微量沉淀法）
• 1.2.8.4 Western 杂交
• 2. 结果与分析
• 2.1 苹果AFS 基因的扩增
• 2.1.1 苹果果皮RNA 的提取及反转录
• 2.1.2 AFS 基因的克隆
• 2.2 RNAi 表达载体的构建
• 2.2.1 PBI 质粒载体的酶切
• 2.2.2 目的片段的PCR 扩增
• 2.2.3 Ri 目的片段的获得
• 2.2.4 重组质粒的酶切回收和PBI—AFS 阳性重组质粒酶切
• 2.3 AFS 基因正义表达载体的构建及烟草转化研究
• 2.3.1 正义表达载体PBI-AFS 的构建
• 2.3.2 表达载体pBI-AFS 的PCR 及酶切鉴定
• 2.3.3 转基因烟草的检测
• 2.3.3.1 转基因烟草的PCR 检测
• 2.3.3.2 AFS 基因原核表达载体的构建及烟草的表达
• 3 讨论
• 3.1 AFS 基因在蛋白水平中的表达分析
• 3.2 苹果双链RNAi 载体研究
• 3.3 进一步研究的设想
• 4. 结论
• 第二部分 苹果再生体系
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 无菌苗体系的建立
• 1.3 培养基
• 1.4 叶片接种培养
• 1.5 培养条件
• 1.6 结果处理
• 2 结果分析
• 2.1 基本培养基对叶片再生的影响
• 2.2 糖的种类和浓度对叶片再生芽的影响
• 2.3 叶片不同接种方向对再生的影响
• 2.4 培养基中激素对叶片再生的影响
• 2.5 不定芽的增殖及生根
• 2.5.1 增殖
• 2.5.2 生根
• 2.5.3 移栽
• 3 讨论
• ４结论
• 第三部分 苹果的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 基因、农杆菌株系及培养基
• 1.1.3 抗生素
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Kan 对苹果叶片再生的影响
• 2.2 抗菌素浓度对再生的影响.
• 2.3 AS 对转化效率的影响
• 2.4 其他因素对转化的影响
• 3 讨论
• 3.1 遗传转化因素分析
• 3.2 选择压的确定
• 3.3 AS 在遗传转化中的作用
• 4 结论
• 4.1 农杆菌介导的苹果遗传转化
• 4.2 根癌农杆菌介导的AFS 基因转化苹果法
• 参考文献
• 附录:常用缓冲液及培养基的配制
• 致谢
• 论文发表情况