弓形虫P24基因敲除质粒的构建及缺陷型虫株建立方法的初步研究

论文摘要

研究目的:建立弓形虫P24基因缺陷型虫株,并对缺陷型虫株建立的条件进行探索。研究方法:（1）弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3的构建根据TgP24基因序列,设计并合成两对特异引物（P1 to P4）,采用PCR技术特异扩增TgP24基因的5’端非翻译区2.5 kb片段（P245’UTR）和3’端非翻译区2.89 kb片段（P24 3’UTR）,将其分别亚克隆入pCR2.1-TOPO TA载体。构建质粒P24 5’UTR/TA和P243’UTR/TA;重组质粒P24 5’UTR/TA经KpnⅠ和BglⅡ双酶切后,再将纯化的P24 5’UTR片段亚克隆入转染质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位点,构建重组质粒pGB-P5（GRA2/Ble-P24 5’UTR）;重组质粒P24 3’UTR/TA经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后,纯化P24 3’UTR片段,再将其定向克隆到重组质粒pGB-P5的BamHⅠ和NotⅠ位点。从而构建TgP24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3。（2）弓形虫P24基因缺陷型虫株筛选条件的建立采用微孔滤膜（孔径为5.0um）过滤法纯化弓形虫速殖子;比较观察电穿孔条件,如电转染缓冲液,电压,电容,脉冲次数对质粒转染虫株的影响。体外比较观察不同宿主细胞（HFF,3T3和L929）对转染虫株药物筛选的影响;比较观察单独细胞内药物筛选和结合细胞外药物低温处理对虫株筛选的影响（细胞中选择培养10天左右,收集虫体,4℃下福来霉素处理5天,再回复到细胞内用选择培养基培养约7天）。（3）弓形虫P24基因缺陷型虫株的建立及鉴定分析应用优化条件的电穿孔方法转染RH株速殖子,以已建立的最佳筛选条件对虫株进行筛选,将虫株继续在细胞中传代培养（12hr）,高倍显微镜下,观察纳虫泡的形成并计数,然后大量收集纯化虫株,用RT-PCR及Western-blot两种方法对各组弓形虫P24基因缺陷型虫株的基因及其蛋白表达进行分析,并对虫株的毒力变化进行了初步观察。研究结果:（1）弓形虫TgP24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3经过PCR筛选、限制性酶切及DNA测序鉴定,证实P24 5’UTR和P24 3’UTR两片段正确插入质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位点,位于药物选择ble基因的上,下游。（2）显微镜检查发现速殖子纯度可达95%,滤膜过滤虫体后,回收率也可达70%-80%;通过比较观察发现,优化电穿孔条件后的弓形虫存活率得到提高（P＜0.05）;采用将细胞内筛选和细胞外药物低温处理相结合的方法对虫株进行筛选较彻底;采用L929成纤维细胞做为转染虫株筛选的宿主细胞其易贴壁生长形成单层,个体较大,细胞传代次数多,生长速度较慢,并且对筛选药物的耐受力为三种细胞中最理想的。（3）高倍显微镜下计数,12hr左右转染虫株在细胞中纳虫泡数为8个/hp,明显低于RH速殖子形成的纳虫泡数19个/hp（P＜0.05）;获得的转染虫株经RT-PCR,Western-blot检测,结果显示L929细胞筛选组虫株的基因及蛋白水平均明显低于HFF和NIH-3T3细胞筛选组虫株:动物毒力试验结果表明,L929细胞筛选组虫株感染小鼠的平均存活时间长于对照组RH虫株。结论:（1）成功构建了弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3,并且插入的靶基因两端的片段较长,有利于提高同源重组效率。（2）确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件以及TgP24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件（采用细胞内筛选和细胞外药物低温处理相结合的方法,福来霉素浓度为5.0μg/ml-7.5μg/ml,采用L929成纤维细胞做为基因敲除虫株筛选的宿主细胞筛选时间较长,筛选效果好）。（3）初步获得了弓形虫P24基因缺陷型虫株,为进一步研究弓形虫TgP24基因缺陷型虫株的生物学特性打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 弓形虫P24基因敲除转染质粒PGB/P5-P3的构建及鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验试剂
• 1.1.2 实验仪器
• 1.1.3 菌株、弓形虫虫株、质粒
• 1.1.4 培养基及主要试剂配制
• 1.1.5 弓形虫TgP24基因分析及引物设计
• 1.1.6 PCR扩增TgP24的5'非翻译区片段（P24 5'UTR）和3'非翻译区片段（P24 3'UTR）
• 1.1.7 P24 5'UTR和P24 3'UTR亚克隆入pCR2.1-TOPO TA载体
• 1.1.8 构建质粒pGB-P5（GRA2/Ble-P24 5′UTR）
• 1.1.9 构建转染质粒pGB/P5-P3（GRA2/Ble-P24 5'UTR-P24 3'UTR）
• 1.1.10 重组质粒pGB/P5-P3的转化
• 1.1.11 重组子质粒的提取
• 1.2 结果
• 1.2.1 P24 5′UTR和P243′UTR的PCR扩增
• 1.2.2 P245′UTR和P243′LLTR亚克隆入pCR2.1-TOPO TA载体的双酶切鉴定
• 1.2.3 pGB-P5的构建
• 1.2.4 转染质粒pGB/P5-P3的构建
• 1.2.5 质粒重组子测序结果
• 1.3 讨论
• 第二章 弓形虫P24基因缺陷型虫株筛选条件的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 弓形虫虫株和细胞株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 溶液和培养基的配制
• 2.1.6 弓形虫RH株速殖子的动物接种
• 2.1.7 弓形虫RH株速殖子的收集与纯化
• 2.1.8 L929、NIH-3T3和HFF三种成纤维细胞的培养
• 2.1.9 无内毒素质粒的提取
• 2.1.10 Tg P24基因敲除质粒转染前的准备和处理
• 2.1.11 不同电穿孔法转染弓形虫RH株
• 2.1.12 单独细胞内药物筛选和结合细胞外药物低温处理转染虫株的观察比较
• 2.1.13 敲除质粒转染虫株在不同细胞中的药物筛选中的观察比较
• 2.2 结果
• 2.2.1 弓形虫RH株速殖子的收集和纯化
• 2.2.2 L929成纤维细胞的培养及弓形虫的体外培养
• 2.2.3 不同电穿孔方法转染后弓形虫活力的比较
• 2.2.4 单独细胞内药物筛选和结合细胞外药物低温处理转染虫株的观察比较
• 2.2.5 基因敲除质粒转染虫株在不同细胞中药物筛选的比较
• 2.3 讨论
• 第三章 弓形虫P24基因缺陷型虫株的建立及鉴定分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 弓形虫虫株和细胞株
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 主要试剂配制
• 3.1.6 优化的高电压转染方法导入基因敲除质粒于弓形虫RH速殖子
• 3.1.7 TgP24基因敲除质粒电转染虫株的筛选及获得
• 3.1.8 RT-PCR检测筛选后的虫株基因P24转录的mRNA
• 3.1.9 蛋白表达产物的Western-blot分析
• 3.1.10 获得的基因缺陷型虫株动物毒力实验观察
• 3.1.11 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 弓形虫P24基因缺陷型虫株的获得
• 3.2.2 RT-PCR结果
• 3.2.3 Western-blot结果
• 3.2.4 L929细胞筛选组获得基因缺陷型虫株的动物毒力实验观察
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间发表的主要论文
• 致谢