论文摘要
第一部分人白介素-2基因转染大鼠肝干细胞系建立及体外分化的基础研究目的：建立能够稳定表达人白介素-2（hIL-2）的大鼠肝干细胞,并探讨该转染后的肝干细胞是否仍然具有自我更新以及向成熟肝细胞分化的能力。方法：（1）建立包装有含hIL-2和EGFP基因的逆转录病毒体系Plpcx-IL-2-EGFP,以之转染肝干细胞WB-F344,并以嘌呤霉素筛选获得抗性克隆,命名为WB-IL-2-EGFP.用RT-PCR、Western blotting等方法检测细胞内hIL-2RNA转录和hIL-2蛋白表达的情况、从而证明WB-IL-2-EGFP细胞具有表达目的hIL-2蛋白的能力。（2）使用由肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）等细胞因子和其他添加成分构成的诱导培养基,体外诱导前面所建立的WB-IL-2-EGFP细胞,观察该细胞是否经体外诱导后仍具有向成熟肝细胞分化的能力。分别观察诱导培养0天、3天、7天和15天的细胞生长情况,通过免疫组化、免疫荧光、Western blotting等试验方法检测不同时间段的细胞中CK19、AFP和ALB蛋白的表达水平,从而分析WB-IL-2-EGFP细胞经诱导分化后的生物学活性。结果：（1）经转染建立的WB-IL-2-EGFP细胞体外生长良好,经多次传代后荧光显微镜下仍可见稳定表达EGFP蛋白的细胞生长；RT-PCR检测hIL-2基因在WB-IL-2-EGFP细胞的转录情况,可见462bp左右目的条带,证明有hIL-2基因的转录；WB-IL-2-EGFP细胞Western blotting检测可于17kD见特异条带,证明有hIL-2的表达。（2）经体外诱导培养的WB-IL-2-EGFP细胞,免疫组化检测显示在不同时间段CK19表达逐步下降,AFP明显下降,免疫组化检测检测显示在不同时间段ALB表达上升,以诱导7天后明显；同样的趋势也在Western blotting检测结果中表现出来。结论：（1）WB-IL-2-EGFP细胞具有持续增殖并具有稳定地表达hIL-2蛋白以及EGFP蛋白的能力；（2）并在HGF、EGF等细胞因子和其他添加成分诱导下,有向成熟肝细胞方向分化的趋势。第二部分人白介素-2基因转染大鼠肝干细胞对肝癌治疗作用的研究目的：研究WB-IL-2-EGFP细胞在受体大鼠肝脏内生长增殖并表达目的基因的能力。研究WB-IL-2-EGFP细胞对肝癌治疗以及肿瘤切除后复发的抑制作用。方法：（1）建立大量肝脏切除大鼠模型,经门静脉注射WB-IL-2-EGFP细胞,一周后通过快速冰冻切片观察该细胞在大鼠肝脏内生长分布情况,RT-PCR、Westernblotting分别检测hIL-2在大鼠肝脏内RNA转录和蛋白表达,检测大鼠血浆内ALT、AST和ALB变化水平来观察注射WB-IL-2-EGFP细胞对大鼠肝功能恢复的影响。（2）分别建立早期、晚期和肝癌切除术后的大鼠肝癌模型,经门静脉注射WB-IL-2-EGFP细胞进入肝癌大鼠,一周后观察早期肝癌、晚期肝癌大鼠肿瘤大小变化以及肝癌切除术后大鼠的复发情况；采集大鼠肝脏,快速冰冻切片,荧光显微镜下观察WB-IL-2-EGFP细胞肝内分布生长情况；采集肝癌大鼠血液,检测ALT、AST和ALB等血液指标,来观察大鼠肝功能变化；ELISA技术检测大鼠血浆中IL-2的表达水平；流式细胞技术检测不同时间点内大鼠血液中NK细胞水平的变化；另外建立长期带瘤肝癌大鼠,观察经门静脉注射WB-IL-2-EGFP细胞后,中位生存时间和生存曲线的变化情况。结果：（1）经肝脏切除大鼠模型门静脉注射WB-IL-2-EGFP细胞后1周,取大鼠剩余肝脏组织,HE染色见肝干细胞移植后大鼠肝脏汇管区单个核细胞明显较未注射大鼠增多,荧光显微镜下见WB-IL-2-EGFP细胞在肝内散在分布,RT-PCR显示出现462bp大小条带,Western blotting检测可于17kD见特异条带,证明有WB-IL-2-EGFP细胞在大鼠肝脏组织内能够增殖生长,并稳定表达目的蛋白hIL-2. WB-IL-2-EGFP细胞注射组和未注射组大鼠的血浆内ALT、AST水平无明显差别,而注射组大鼠血浆内ALB水平较未注射组明显高（p<0.05）。（2）荧光显微镜下见WB-IL-2-EGFP细胞于肝脏肿瘤组织周围聚集,并稳定表达目的基因。在早期肝癌大鼠模型和晚期大鼠肝癌模型中,WB-IL-2-EGFP细胞注射组肿瘤大小均小于未注射组,以早期组明显（p<0.01）,肝功能也较未注射组佳。而在肝癌切除大鼠中,而注射组肝功能佳,ALT、AST低于无注射组（p<0.05）,ALB高于无注射组（p<0.01）。在晚期肿瘤大鼠中,注射组血浆IL-2水平较未注射组明显高（p<0.05）。早期肝癌大鼠中NK细胞比例无显著差别,而在晚期肿瘤组中,注射组明显较未注射组高（p<0.01）。肝癌切除大鼠中,注射组的NK细胞比例也较未注射组高（p<0.05）。注射WB-IL-2-EGFP细胞能够延长肝癌大鼠生存时间,注射组中位生存时间明显较未注射组长（27：45 d,P=0.038<0.05）。结论：WB-IL-2-EGFP细胞能够在肝脏损伤大鼠的肝脏中定位、增殖并稳定表达IL-2. WB-IL-2-EGFP细胞具有一定趋向肿瘤作用。对于早期肝癌,WB-IL2-EGFP细胞抑制肿瘤生长作用较明显；而对于晚期肝癌,WB-IL2-EGFP细胞能够较好改善肝功能,增加IL-2分泌,从而刺激淋巴细胞中NK细胞比例,来抑制肿瘤转移、延长带瘤生存时间。进一步证明肝干细胞作为一种基因治疗的载体的可行性。
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