小鼠精子发生相关蛋白表达谱的构建及蛋白LaminA/C的功能研究

论文摘要

精子发生是雄性生殖细胞特有的一个生物学事件,原始生殖细胞需要经历有丝分裂、减数分裂和精子变形等阶段才能成为成熟精子。我们借助于二维电泳的技术手段,对小鼠第一个精子发生波进行了蛋白质组学的研究,成功构建了不同周龄小鼠睾丸差异蛋白的表达谱。通过对这些差异蛋白进行聚类分析,得到了6类表达模式,并挑选了部分蛋白进行了前瞻性的定位研究。这些蛋白在体细胞中已有相关的功能报道,其在睾丸中的定位研究结果也说明,我们构建的谱系能很好的提示蛋白在生精过程中所起的作用。Lamin A/C是基因lmna的两种剪接形式,在第一波小鼠精子发生的两个阶段高表达。现有的关于Lamin A/C的报道都认为其只定位于支持细胞和早期生殖细胞,而Lamin A/C对应的基因lmna被敲除后能引起减数分裂阻滞,导致雄性小鼠不育[1],这与其在我们谱系中出生后0天,7天高表达的表达模式是一致的;但其在28天时出现了第二波表达高峰则提示我们Lamin A/C在精子发生的后期阶段也有着很重要的作用。Western blot结果证实Lamin A/C在小鼠睾丸和精子中均有表达,而免疫荧光的结果表明Lamin A/C定位于精子细胞的顶浆复合物,说明Lamin A/C可能参与了小鼠精子的变形,对此我们进行了更深一步的功能研究。精子变形是精子发生的一个特殊阶段,由于缺乏有效的研究手段,目前针对这方面的研究主要借助于形态学观察和基因敲除的方法,进展也相对比较缓慢。近些年出现的RNAi技术因其便利、高效而得到了广泛的应用,并为我们研究精子变形提供了新的思路和方法。本研究中,我们探索了一个新的简便有效的在体RNAi的方法:显微注射结合RNAi的技术,并利用此方法对Lamin A/C在小鼠精子变形过程中的作用进行了研究。利用活体小鼠睾丸网显微注射技术,将混有台盼兰作为指示剂的Lamin A/C的干涉片段注入青春期前小鼠睾丸的生精小管,待小鼠成年后观察其附睾尾精子来研究lamin A/C在精子变形过程中的作用。在Lamin A/C被knock-down后,小鼠精子的顶体形成及核变形明显异常,产生了圆头精子等各类畸形精子,这也证明lamin A/C确实参与了小鼠精子的变形,同时也说明了显微注射结合RNAi的技术在精子变形相关基因功能研究中是有效可行的。随后通过免疫共沉淀结合质谱分析鉴定了Lamin A/C的相互作用蛋白CLIP-170。CLIP-170已被证实与精子颈带相关, CLIP-170被knock-out后,小鼠精子变形不能正常进行。顶体-顶浆-颈带三者在小鼠精子变形过程关系密切,正常情况下Lamin A/C定位于顶浆,并与定位于颈带的CLIP-170相互作用[2],使得精子变形能顺利进行。综上,差异蛋白谱的构建使我们能从一个全新的角度来了解精子发生这一过程。在后续研究中我们首次发现并证实了差异蛋白Lamin A/C定位于小鼠精子顶浆复合物,并可能通过与CLIP-170相互作用,参与小鼠精子变形。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 一、 实验材料
• 二、 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 发表文章及待发表文章目录
• 致谢