乙型肝炎病毒基因（S、X）载体构建表达及功能研究

论文摘要

目的分别构建乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）S基因（包括Pre-S1，Pre-S2和S）和X基因的带FLAG标签的真核表达载体，并进行有效表达，进而通过高通量蛋白质技术获取与X蛋白相互作用的蛋白质复合物，以期为进一步研究乙型肝炎病毒外膜蛋白及X蛋白的功能打下基础。方法以质粒pcDNA3.1-HBV为模板，通过PCR技术扩增HBV基因组Large surface antigen（LS）、Middle surface antigen（MS）、Smallsurface antigen（SS）和X基因片段；将PCR克隆获得的目的基因片段分别插入真核表达载体pCMV-tag2B，构建重组质粒pCMV-tag2B-LS、 pCMV-tag2B-MS、 pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X，并送测序鉴定。将鉴定正确后的目的基因表达载体分别转染293FT细胞，Western blot检测其表达。继而应用FLAG亲和层析柱分离HBX复合体，iTRAQ标记后用串联质谱对其进行鉴定。选择三次实验中只在HBX复合体中鉴定的蛋白质作为进一步功能分析的侯选蛋白。通过免疫共沉淀和免疫共定位，进一步确认侯选蛋白G6PD与HBV-x蛋白相互作用。结果分别用相应内切酶酶切重组真核表达载体pCMV-tag2B-LS、 pCMV-tag2B-MS、 pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X，各切出两个片段，大片段大小与pCMV-tag2B空质粒大小一致，小片段大小分别与对应目的基因片段LS、MS、SS和X大小一致，且测序结果表明，重组真核表达载体分别含有相应的完整的目的基因片段。Western blot检测结果表明，转染了表达载体pCMV-tag2B-LS、pCMV-tag2B-MS、pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X的293FT细胞分别在43KDa、34KDa、24KDa和17Kda处各出现了强反应条带。空白对照均未见相应条带出现。应用FLAG亲和层析柱，成功的分离出HBx复合体，iTRAQ标记后用串联质谱对其进行鉴定。三次实验中，58个只在HBX复合体的蛋白质得到鉴定，包括G6PD。通过免疫共沉淀和免疫共定位，明确侯选蛋白G6PD与HBx蛋白存在相互作用。结论成功构建乙型肝炎病毒S基因和X基因的真核表达载体pCMV-tag2B-LS、 pCMV-tag2B-MS、 pCMV-tag2B-SS和pCMV-tag2B-X，并能正确表达。同时成功的分离并鉴定出HBx复合体，明确了侯选蛋白G6PD与HBx蛋白存在相互作用，为进一步研究乙型肝炎病毒X蛋白和外膜蛋白的功能打下基础。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 乙型肝炎病毒 S 基因和 X 基因载体的构建及表达
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二部分 HBX蛋白复合物的分离和鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3.实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录