论文摘要
研究背景肺癌是严重危害人类生命和健康的常见疾病,目前国内外肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。由于大多数肺癌患者临床确诊时已属晚期,其中50%以上患者不能手术,而绝大部分肺癌患者（占肺癌的75%～80%,包括鳞癌、腺癌等）对现行放疗和化疗又不够敏感,尽管已经联合应用手术、放疗、化疗、生物治疗等各种手段,但其预后改善并不明显,深入研究肺癌分子生物学特征对肺癌的早期诊断、治疗及改善预后具有重要意义。因此肺癌的治疗成为临床治疗一大难题,目前基因治疗和化疗耐药的研究已成为肺癌的热门课题。NPRL2是一种最新发现的抑癌基因,目前国外少数专家的研究发现:其在肿瘤发生、发展中起着重要作用,特别是该基因的表达缺失导致了肿瘤细胞对顺铂的耐药发生的特点,从而让我们有理由相信:抑癌基因NPRL2的转染与导入必将抑制肿瘤细胞增值、诱导凋亡及逆转顺铂类的耐药从而使NSCLC的治疗可能进入一个崭新的境界。我们率先对NPRL2基因进行了临床研究,利用免疫组化技术对我国的非小细胞肺癌患者进行回顾性研究,发现该基因在NSCLC的病理组织中和多种肺癌细胞株上具有较高的缺失率,从而给我们的下一步研究工作奠定了基础。本研究试图利用分子生物学和细胞生物学途径,构建NPRL2基因载体,建立稳定高表达NPRL2蛋白的肺癌细胞株,利用质粒构建—成功转染—稳定培养的细胞株来研究转染NPRL2基因对肺癌细胞生长抑制及其作用机制。我们将利用耐顺铂人肺腺癌细胞株（A549/CDDP）进行体外的实验研究:NPRL2基因转染可以逆转A549/CDDP细胞株中NPRL2基因缺失表达,并能抑制细胞增殖、诱导其凋亡、逆转顺铂类的耐药,从而明显抑制A549/CDDP细胞株的生长。为进一步进行肺癌基因治疗的临床前期研究提供了理论依据和实验基础。第一章NPRL2在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义目的:检测NPRL2蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达,探讨其临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测80例非小细胞肺癌组织及13例正常肺组织中NPRL2蛋白的表达,分析其表达和临床病理以及术后随访资料的相关性。Cox多因素分析肺癌临床病理特征指标及NPRL2表达对NSCLC预后的影响。结果:肺癌中NPRL2蛋白阳性表达35例（43.8%）,正常肺组织中阳性表达12例（92.35%）,两者差异显著（P＜0.05）。肺鳞癌中阳性表达14例（33.33%）,肺腺癌中阳性表达21例（55.26%）,二者差异显著（P＜0.05）;NPRL2蛋白在Ⅰ期阳性表达率为69.24%（9/13）;Ⅱ期为46.15%（18/39）,ⅢA期为45.32%（26/47）,NPRL2蛋白在非小细胞肺癌中随着TNM分期的增加表达增强（P＜0.05）。NPRL2蛋白在有淋巴结转移的NSCLC(N1-2)中阳性表达率为27.28%（9/33）,在无淋巴结转移的NSCLC（N0）中阳性表达率为45.32%（26/47）,差异显著（P＜0.05）。NPRL2蛋白表达缺失与年龄、性别、吸烟等因素无关。NPRL2蛋白阳性表达组的病人无瘤生存时间显著高于阴性组（p=0.026）。COX多因素分析结果显示UICC分期、NPRL2表达和有无复发或转移3个因素对生存率的影响有统计学意义。结论:新抑癌基因NPRL2缺失在肺癌的发生、发展及侵袭转移中可能起重要作用;NPRL2可能成为预测肺癌预后的新的肿瘤标志物。第二章NPRL2基因转染对肺癌A549/GDDP细胞肿瘤生物学行为的影响目的:探讨NPRL2基因转染对肺癌细胞株A549/CDDP肿瘤生物学行为的影响。方法:利用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3.1-NPRL2,脂质体life2000介导转染体外培养的肺癌细胞株A549/CDDP,G418筛选获得稳定表达NPRL2的细胞株,MTT方法、划痕愈合实验和侵袭小室实验检测转染前后A549/CDDP的肿瘤生物学行为。结果:A549/CDDP细胞在转染NPRL2基因后,克隆形成数减少,克隆体积较小,数目且排列较散,克隆形成率为12.6%;而转染空白质粒组克隆形成数较多,克隆体积较大,数目且排列紧密,克隆形成率分别为19.5%,两者差异有显著性（P＜0.05）。表明NPRL2转染A549/CDDP细胞后的增殖能力明显低于转染空质粒组和未转染组细胞;A549/CDDP细胞转染NPRL2后迁移细胞数为14.09±4.23个,显著低于pcDNA3.1组34.18±9.77个,A549/CDDP组36.14±8.50个（P＜0.05）。表明NPRL2转染A549/CDDP细胞后显著降低其迁移力;A549/CDDP细胞转染NPRL2后穿透matrigel的细胞数为74.09±4.48个,显著低于pcDNA3.1组124.18±6.43个,A549/CDDP组120.14±7.25个（P＜0.05）。表明NPRL2转染A549/CDDP细胞后显著降低其侵袭力。结论:抑癌基因NPRL2的转染可以抑制A549/CDDP细胞的增殖和侵袭运动。第三章NPRL2基因转染诱导A549/CDDP细胞凋亡、逆转其耐药性的研究目的:探讨新抑癌基因NPRL2在逆转A549/CDDP耐药性和诱导细胞凋亡的作用和机制。方法:用0、10、40、160、320um01/mL浓度梯度的CDDP处理稳定表达NPRL2的A549/CDDP细胞后,MTT检测细胞增殖、检测A549细胞和A549/CDDP细胞对顺铂的耐药指数;流式细胞术检测细胞周期变化;激酶法检测NPRL2转染对A549/CDDP细胞Caspase-3活性的影响,细胞免疫组化检测Blc-2、Bax、P53和LRP蛋白的表达。结果:pcDNA3.1-NPRL2组细胞死亡率随顺铂浓度的增加而显著增加与pcDNA3.1组、A549/CDDP组的差异有统计学意义（P＜0.05）,而pcDNA3.1组、A549/CDDP组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。提示NPRL2的转染可增强的A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性。pcDNA3.1-NPRL2转染组对顺铂的半数抑制浓度IC50为156.91±3.02μmol/L,对顺铂的耐药指数为7.62。对照组中转染pcDNA3.1和A549/CDDP对顺铂的半数抑制浓度IC50为226.53±2.31和226.71±0.01μmol/L,对顺铂的耐药指数为11.17和11.39,比较差异有显著性（P＜0.05）。提示NPRL2转染可以逆转A549/CDDP细胞的耐药性。且pcDNA3.1-NPRL2对肺腺癌A549/CDDP细胞存活率的抑制呈现出时间依赖性,与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）;在稳定转染NPRL2基因后A549/CDDP细胞生长缓慢,G0-G1期增多,与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）;pcDNA3.1-NPRL2转染组在不同时间点均可使得A549/CDDP细胞Caspase-3活性增高,以48h最为显著,其相对活性为1.1298±0.2502,与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）;NPRL2高表达明显下调LRP蛋白和bcl-2蛋白,上调bax蛋白表达,与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。结论:NPRL2基因的转染可诱导A549/CDDP细胞的凋亡、逆转其耐药性;其作用机理可能与通过增加Caspase-3活性、下调LRP、bcl-2蛋白表达及上调bax蛋白表达有关。
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