PCR-ACRS法筛查成年汉族人CYP21基因P459H的突变位点

论文摘要

目的:先天性肾上腺皮质增生症（CAH）是一种较常见的常染色体隐性遗传病,由21-羟化酶缺陷引起者约占90%～95%。此酶由21-羟化酶基因编码,缺乏可引起皮质醇合成不足以及前体底物堆积。主要临床表现是性发育畸形:女性患者外生殖器男性化,男性患者出现假性性早熟。21-羟化酶基因位于人类6号染色体短臂6p21.3组织相容性抗原Ⅲ（HLAⅢ）基因区,由无活性的假基因（CYP21P）和有活性的真基因（CYP21）串联排列组成。大约95%的CYP21基因突变是由于真假基因相互作用引起,其余5%的患者等位基因含有特别的突变。迄今已发现80余种CYP21基因突变导致21-羟化酶缺陷症（21-OHD）,目前国内仅是对较常见的9个突变进行检测,尚未见新的基因突变报道。我们在前期工作中收集了3个21-OHD家系,采用PCR扩增产物直接测序的方法,对患者及其家系进行基因突变分析,发现了一个国内外尚未见报道的新突变P459H（即外显子10第459位密码子CCC突变为CAC,导致编码蛋白质上相应的脯氨酸变为组氨酸）。为进一步验证该基因突变确实属于点突变,而非基因多态,本研究采用PCR结合扩增引进限制性内切酶酶切位点（PCR-ACRS）的方法对100名正常成年汉族人该位点进行分析。方法:1例CAH患者,社会性别为女性,通过临床表现,皮质醇、促肾上腺皮质激素（ACTH）、17-羟孕酮（17-OHD）、睾酮（T）等激素测定和影像学检查确立诊断。100例正常成年汉族人从山东大学齐鲁医院健康查体中心随机选取,平均年龄（28±5）岁,其中男性52例,女性48例。相互之间无亲缘关系,排除CAH家族史。取受检者外周静脉血2ml,EDTA-K2抗凝。抽提基因组DNA,根据真假基因序列的差别,设计特异性引物扩增CYP21基因3～10外显子,PstⅠ限制性内切酶消化验证PCR产物为特异性扩增。应用PCR-ACRS方法扩增所有样本的首次PCR产物,FspⅠ限制性内切酶酶切后用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）筛查P459H变异的发生率。结果:1.首次PCR扩增产物即CYP21基因第3～10外显子用PstⅠ限制性内切酶酶切,由于真假基因上PstⅠ限制性内切酶酶切位点数目不同,造成酶切片段大小不同,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,可以鉴别真假基因,经PstⅠ限制性内切酶证实所扩增的均为真基因序列。2.患者CYP21基因第10外显子携带P459H变异（CCC→CAC）,100例正常成年汉族人CYP21基因第10外显子密码子459均为CCC,即均未出现P459H变异。结论:1.PCR扩增的CYP21基因第3～10外显子序列,经PstⅠ限制性内切酶酶切可以有效鉴别真假基因。2.1 00例正常成年汉族人均没有携带P459H变异,从而排除了该位点基因多态的可能。P459H点突变首次在中国人21-OHD患者中发现,国外并未有关这一突变的报道,推测可能为一罕见突变。3.PCR-ACRS是一种快速、可靠的检测基因点突变的有效途径。

论文目录

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• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章
• 学位论文评阅及答辩情况表