论文摘要
第一部分LRP16基因在子宫内膜癌组织中的表达研究目的：①建立子宫内膜癌组织LRP16基因mRNA的提取方法；②初步研究子宫内膜癌组织和癌旁正常子宫内膜组织的LRP16基因表达特点，为进一步分析LRP16基因在子宫内膜癌发病过程中的变化特点意义奠定基础。方法：收集子宫内膜癌手术切除的新鲜组织标本和部分临床病理诊断资料，采用Northern Blot方法检测子宫内膜癌及癌旁临床组织标本的LRP16基因mRNA的表达水平。结果：①成功建立子宫内膜癌组织提取LRP16基因的方法。②以β-actin为内参照，6例子宫内膜癌组织标本中有2例LRP16 mRNA表达较癌旁正常子宫内膜组织明显增高。结论：①LRP16基因作为组成基因在子宫内膜组织中均有表达。②子宫内膜癌患者中，1／3患者存在LRP16 mRNA过表达，提示LRP16基因可能在子宫内膜癌组织中存在过表达。第二部分LRP16基因的多克隆抗体制备及初步应用目的：制备兔抗人LRP16蛋白多克隆抗体，并利用该抗体检测LRP16蛋白的在不同组织中的分布特点及亚细胞定位，初步分析LRP16蛋白在女性生殖系统正常组织及肿瘤组织中的表达特点，以及与雌激素受体表达的相关性。方法：采用RT-PCR方法提取正常人外周血LRP16基因，采用PCR方法扩增后，与PT-Adv载体连接，表达产物提取质粒，测序无误后进行双酶切，重新连接LRP16基因和原核表达载体pRSET-C，连接产物转化BL21（DE3）缺陷型大肠杆菌。诱导该基因原核表达，快速蛋白免疫法免疫新西兰长毛兔，ELISA法监测抗体效价，获取抗LRP16基因的多克隆抗体。利用Western blot方法检测该抗体在不同LRP16基因抑制率的乳腺癌细胞系MCF-7的结合效率，评价该多克隆抗体的免疫学活性及免疫学特异性。采用免疫组化法观察LRP16基因产物在女性子宫内膜癌、乳腺癌、子宫内膜异位症等疾病的正常组织和肿瘤组织中的表达差异。结果：成功获得高效的LRP16多克隆抗体，该多克隆抗体具备良好的免疫学活性及特异性。利用该抗体初步证实LRP16基因编码产物主要在细胞浆和细胞核中表达，且以上皮细胞为主。LRP16蛋白表达与雌激素受体表达可能存在正相关。结论：制备的LRP16抗体及其全长基因可用于LRP16基因的生理功能及病理学研究，LRP16基因主要在生长活跃的细胞，尤其是上皮细胞中表达。初步发现LRP16基因的表达与雌激素受体呈正相关。第三部分LRP16通过ERα介导抑制了Ishikawa细胞中E-钙黏着素的转录活性目的：既往研究表明LRP16基因过表达通过下调E-钙黏着素蛋白（E-cadherin）促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的侵袭生长，本研究目的在于探讨LRP16下调E-cadherin的分子途径。方法：免疫组化方法检测LRP16基因过表达Ishikawa细胞中E-cadherin的表达；共转染与荧光素酶实验检测LRP16基因对E-cadherin启动子转录活性的影响；染色质免疫共沉淀实验检测雌激素受体α（ERα）与LRP16在E-cadherin启动子区的招募状况。结果：E-cadherin在LRP16过表达的Ishikawa细胞中的表达水平明显下调；LRP16抑制了E-cadherin启动子的转录活性，该效应呈现对雌激素（E2）存在的依赖性特征；LRP16本身没有与E-cadherin启动子区结合，但明显抑制了ERα与E-cadherin启动子区的结合。结论：LRP16通过抑制ERα对E-cadherin基因的转录激活活性下调E-cahderin在Ishikawa细胞中的表达水平。