牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA的建立与应用

论文摘要

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR）,是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。IBR被世界动物卫生组织（OIE）列为B类传染病,也是我国进境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象。因此,加强IBR诊断技术的研究工作对预防和控制本病具有重要的现实意义。目前,国内还没有商品化的检测IBR的诊断试剂,口岸动物IBR的检测处于严重依赖国外试剂盒的状况。为此,本研究用大肠杆菌表达了牛传染性鼻气管炎病毒gD基因,将重组蛋白纯化后作为包被抗原建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法。gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面,是刺激机体产生中和抗体的主要结构蛋白,是IBR诊断试剂中特异性抗原的首选蛋白。本实验将IBRV gD基因的重组质粒pET30a-gD转化BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导得到了大量可溶性表达的重组蛋白,采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.128 mg/ml,纯度为96 %。Western blot和间接ELISA检测证明纯化后的重组蛋白可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别,具有良好的反应原性。将大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白,纯化后作为包被抗原建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA诊断方法,将其命名为gD-ELISA。通过一系列试验,确定了底物液中TMB最佳使用浓度（0.4mg/ml）;DMSO最佳使用浓度（15%）;0.75 %过氧化氢尿素最佳使用浓度（25.6μl/ml）;重组抗原最佳包被浓度（6.4μg/ml）;最佳封闭液（含10%马血清的PBST）和最佳封闭时间（1h）;血清样本最佳稀释度（1:80）和最佳作用时间（1.5 h）;酶标二抗最佳工作浓度（1:5000）和最佳作用时间（1h）;底物最佳显色时间（15min）和终止液最佳作用时间（5min）;判定临界值（PR≥38.0为阳性,PR<30.8为阴性）。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见5种牛病的阳性血清不发生交叉反应。阻断试验表明,IBRV细胞培养液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显的影响。重复性试验表明,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与病毒中和试验相比,符合率、敏感性和特异性分别为84.1 %、85.0 %和83.4 %。与本实验室已建立的IBRV全病毒ELISA诊断方法相比,符合率、敏感性和特异性分别为91.9 %、94.2 %和90.2 %。应用IBRV gD-ELISA检测了国内11个省份的2012份血清样本,得出国内平均血清抗体阳性率为46.0 %（926/2012）。上述结果表明,IBRV gD-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性,显示出了良好的应用前景。本研究成功诱导表达了gD基因,获得了以可溶性表达的目的蛋白,为研究gD基因的功能奠定了良好的基础。利用纯化的重组蛋白成功建立了快速简便的IBRV gD-ELISA诊断方法,为IBR的检疫、诊断、抗体监测、预防及控制措施提供了坚强的技术支持,为开发IBR商品化诊断试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 牛传染性鼻气管炎概述
• 1.1.1 牛传染性鼻气管炎发展史简介
• 1.1.2 牛传染性鼻气管炎病毒的形态及其编码的主要蛋白
• 1.1.3 牛传染性鼻气管炎流行病学及病理变化
• 1.1.4 牛传染性鼻气管炎诊断及防治
• 1.2 牛传染性鼻气管炎诊断方法的研究进展
• 1.2.1 传统的诊断方法
• 1.2.2 分子生物学诊断方法
• 1.3 本课题研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 细胞与病毒
• 2.1.2 质粒与菌株
• 2.1.3 实验用血清
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 重组蛋白的表达
• 2.2.2 重组蛋白表达条件的优化
• 2.2.3 重组蛋白表达效率的测定
• 2.2.4 重组蛋白表达形式的鉴定
• 2.2.5 表达产物的纯化
• 2.2.6 表达蛋白的活性检测
• 2.2.7 病毒中和试验
• 2.2.8 间接ELISA 操作程序
• 2.2.9 牛传染性鼻气管炎gD-ELISA 诊断方法相关条件的优化
• 2.2.10 牛传染性鼻气管炎 gD-ELISA 阴阳性判定标准的确定
• 2.2.11 特异性试验
• 2.2.12 重复性试验
• 2.2.13 牛传染性鼻气管炎gD-ELISA 与病毒中和试验的相关性
• 2.2.14 牛传染性鼻气管炎gD-ELISA 的应用
• 2.2.15 诊断试剂的保存期试验
• 3 结果与分析
• 3.1 重组蛋白GD 的表达结果
• 3.2 PET30A-GD 重组蛋白最佳表达条件的确定
• 3.2.1 最佳IPTG 诱导浓度的确定
• 3.2.2 最佳诱导时间的确定
• 3.3 重组蛋白表达效率的测定结果
• 3.4 重组蛋白表达形式的鉴定结果
• 3.5 表达产物的纯化结果
• 3.6 表达蛋白的活性检测结果
• 3.6.1 WESTERN-BLOT 检测结果
• 3.6.2 间接ELISA 检测结果
• 3.7 病毒中和试验结果
• 3.7.1 病毒毒价的测定结果
• 3.7.2 血清中和试验的测定结果
• 3.8 牛传染性鼻气管炎GD-ELISA 相关条件优化的结果
• 3.8.1 底物液中TMB、DMSO 和0.75 %过氧化氢尿素最佳使用浓度的确定结果
• 3.8.2 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定结果
• 3.8.3 最佳封闭液与最佳封闭时间的确定结果
• 3.8.4 血清最佳作用时间的确定结果
• 3.8.5 二抗最佳工作浓度与最佳作用时间的确定结果
• 3.8.6 底物最佳显色时间的确定结果
• 3.8.7 终止液最佳作用时间的确定结果
• 3.9 牛传染性鼻气管炎GD-ELISA 阴阳性判断标准确定结果
• 3.10 特异性试验结果
• 3.10.1 阻断试验结果
• 3.10.2 交叉反应试验结果
• 3.11 重复性试验结果
• 3.11.1 批内重复性试验结果
• 3.11.2 批间重复性试验结果
• 3.12 牛传染性鼻气管炎GD-ELISA 与病毒中和试验相关性试验结果
• 3.13 牛传染性鼻气管炎GD-ELISA 的应用结果
• 3.14 诊断试剂的保存期试验结果
• 4 讨论
• 4.1 应用ELISA 检测牛传染性鼻气管炎抗体的优越性
• 4.2 间接ELISA 包被抗原的选择
• 4.3 牛传染性鼻气管炎GD-ELISA 反应条件的优化
• 4.4 牛传染性鼻气管炎GD-ELISA 判定标准的确定
• 4.5 ELISA 包被抗原的保存
• 4.6 牛传染性鼻气管炎gD-ELISA诊断方法的应用评价及国内IBR 流行情况
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文