论文摘要
研究背景:肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时,肝脏细胞外基质分泌与降解失衡,从而在肝细胞的间隙可逆性沉积的结果;是多种肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段;成为诸多肝脏疾病预后与转归的关键。因此,抑制甚至逆转肝纤维化的进展,具有重要意义。多年来,抗肝纤维化的药物层出不穷,但是至今尚未出现理想的治疗药物。近年来以细胞为基础的肝病治疗方面的研究逐渐深入,目前研究较多的是骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞及早期胚囊来源的干细胞、中期妊娠的胚胎肝脏来源的干细胞等。干细胞免疫原性低,移植后排斥反应小,更易于基因修饰。胎肝来源的肝母细胞,在治疗肝病方面,具有“天然”优势:移植后靶向性强,在受体肝脏中更容易向肝实质细胞分化。中期妊娠的胎肝肝母细胞含量丰富,它们具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能。另外肝纤维化相关因子的基因治疗也呈现出良好前景。从肝母细胞含量丰富的大鼠中期妊娠（ED14.5）的胚胎肝脏中,以机械分离法、OX43/OX44免疫吸附法等分离纯化出肝母细胞并对其进行鉴定;细胞培养:体外培养肝母细胞,分析SCF、bFGF、EGF和LIF等细胞因子对肝母细胞增殖和分化的影响,选出既能刺激肝母细胞增殖同时又抑制其分化的细胞因子（组合）;鉴定细胞的分化状态;载体构建:在pEGFP-C1质粒基础上构建大鼠HGF基因和绿色荧光蛋白基因共同表达的融合载体;转染:用脂质体转染法将该质粒转染到肝母细胞中,通过绿色荧光蛋白和HGF的表达情况检测该质粒的细胞内工作状态;细胞移植:将能够表达HGF的细胞移植到CCl4肝纤维化大鼠体内,检测不同时间段肝纤维化大鼠肝功能和血清肝纤维化指标,血清中HGF及TGFβ1的浓度,肝组织中荧光蛋白数量和分布,肝组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的沉积情况以及肝组织内HGF及其受体和TGFβ1的表达水平。综上所述,本研究在传统方法上改进的肝母细胞分离纯化方法,兼顾操作简单,细胞产量大,细胞活性高的优点,适合用于胎肝来源肝母细胞的规模化生产。HGF是一种具有抗肝纤维化作用的细胞因子,而胎肝来源的肝母细胞具有很强的肝靶向性,移植后能归巢于受体肝脏,并增殖分化。本研究将载有HGF基因的肝母细胞既可以分化为具有正常功能的肝实质细胞而发挥治疗作用,又能够表达HGF,这两个方面互相促进,逆转了肝纤维化,改善了肝功能。