论文摘要
目的大面积颅骨缺损的修复一直是神经外科临床工作的一个重点，其关键问题是修复材料的来源，而传统的修复材料存在各种各样的缺点。随着组织工程的飞速发展，体外预构的组织工程骨有可能为颅骨缺损提供较理想的修复方式。本实验探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生物学特性和成骨分化能力，研究以BMSCs为种子细胞、10％珊瑚羟基磷灰石（CHA）为细胞外基质材料构建的组织工程骨的成骨能力。一、鼠BMSCs的生物学特性和向成骨细胞诱导分化的能力方法以贴壁筛选法获得鼠BMSCs，原代培养后1：3传代，分别接种于普通DMEM培养基（A组）和添加成骨诱导剂(含10-9mol／L地塞米松（DEX）、10mmol／Lβ-甘油磷酸钠和50mg／L L-抗坏血酸（L-ASC）)的DMEM培养基（B组）。定期更换培养基，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。用MTT法分析BMSCs在两种培养条件下的生长活力。检测两种培养条件下BMSCs向成骨细胞分化的指标，包括定量法检测第5、10、15、20天时碱性磷酸酶（ALP）的表达，免疫组化法检测第4周时BMSCs分泌Ⅰ型胶原和四环素荧光法检测第5周时矿化结节的形成。结果贴壁筛选法从骨髓中获得可贴壁增殖、呈纺锤形的BMSCs。在普通培养（A组）和成骨诱导培养（B组）条件下BMSCs从第3天开始快速增殖，第8天达到最高峰；在3-8天细胞数两组间有显著差异性。ALP定量检测示B组BMSCs在15天时表达量明显升高，有显著差异性。4周时Ⅰ型胶原免疫组化B组阳性率90％，A组无阳性细胞。5周时矿化结节四环素染色于荧光显微镜下可见B组矿化结节呈黄绿色，A组无矿化结节。结论骨髓是良好的间充质干细胞来源，通过贴壁法能从鼠骨髓中提取到BMSCs，经过培养传代后可获得足量的细胞。10-9mol／L DEX、10mmol／Lβ-甘油磷酸钠和50mg／L L-ASC联合诱导下，能够明显促进BMSCs向成骨方向的分化，表现为ALP的表达、Ⅰ型胶原的分泌和矿化结节形成，是促使BMSCs向成骨方向分化的良好的诱导剂。通过诱导BMSCs成骨分化并结合细胞形态学观察，可以初步鉴定所获得的成纤维样细胞符合BMSCs的特点。二、鼠BMSCs复合10％珊瑚羟基磷灰石修复颅骨缺损方法原代培养的鼠BMSCs以1：3传代，接种于添加成骨诱导剂(10-9mol／LDEX、10mmol／Lβ-甘油磷酸钠和50mg／L L-ASC)的DMEM培养基。定期更换培养基，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。收集第4代经成骨诱导的细胞，以5×107／ml的密度接种于10％CHA，培养1，3和7天后作扫描电镜检查。以培养7天的10％CHA+BMSCs复合物植入兔颅骨直径2.5cm缺损处为实验组（A组，n=8）；单纯植入CHA（B组，n=4）和无任何植入物（C组，n=4）为对照组。A组于6和12周、B和C组于12周时行X线检查；行X线后分别处死动物，观察修复后颅骨表面的完整性、硬度、与周围自体骨质的结合情况等；然后取材固定、脱钙、包埋、切片，行HE染色。结果BMSCs向成骨诱导分化后，与10％CHA复合培养3-7天，扫描电镜显示细胞能在10％CHA很好地黏附生长。大体观察可见A组6、12周时新生骨质地硬，与周围自体骨结合紧密；B组12周时表面粗糙，呈颗粒状，质地软，周围包绕软组织囊；C组仅有软组织填充。X线检查可见A组植入物与自体骨密度基本一致，两者结合紧密；B组密度明显降低，呈颗粒状密度影，和自体骨结合不紧密；C组仅可见软组织密度影。HE染色示A组有大量新骨形成，新生骨之间相互结合，有血管长入，未见炎细胞和淋巴细胞浸润。B组可见材料明显降解，无新生骨。C组仅可见结缔组织。结论10％CHA有良好的生物相容性、良好的细胞材料表面、适当的生物降解性和三维立体结构，是骨组织工程良好的细胞外基质材料。BMSCs是骨组织工程理想的种子细胞，可在10％CHA表面紧密黏附生长。以BMSCs为种子细胞，10％CHA为支架材料构建的组织工程骨，在兔颅骨缺损处有明显的成骨，无明显的免疫排斥反应，可能成为临床颅骨缺损修复的骨来源之一。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 珊瑚羟基磷灰石论文; 异种移植论文; 组织工程骨论文;