大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸—糖磷酸转移酶系统（PTS系统）分子改造及敲除菌性能测定

论文摘要

磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（简称PTS系统）在葡萄糖磷酸化和转运过程中起重要作用,利用I-SceⅠ介导的Red同源重组技术敲除大肠杆菌ptsG基因和ptsHIcrr操纵子,考察缺陷株生长性能及其可能的应用。通过重叠PCR构建含有待敲除基因上下游同源臂及两端含有18bp特异序列的打靶片段,酶切连接等得到高拷贝打靶质粒,打靶质粒和辅助质粒经电转化至宿主菌体内,在L-阿拉伯糖的诱导下辅助质粒表达归巢内切酶和Red重组酶,打靶片段与染色体上同源区域重组,基因剔除。一步无痕敲除了大肠杆菌DH5α、JM109、HB101、Bl21（DE3）的ptsG基因和DH5α的ptsHIcrr操纵子;在含1%葡萄糖的LB培养基中,DH5α△ptsG、JM109△ptsG、HB101△ptsG、Bl21（DE3）△ptsG最高菌体密度依次是亲本的2.99、3.49、1.58、1.70倍;DH5α△ptsHIcrr最高菌密度是亲本的1.51倍;E.coli K12菌株DH5α△ptsG、JM109△ptsG产乙酸能力下降,基因芯片结果揭示ptsG敲除菌对敲除菌新陈代谢有广泛影响,尤其是糖酵解循环减弱,而三羧酸循环加强,使得两循环之间趋于平衡。在LB培养基中,DH5α△ptsHIcrr的生长行为与DH5α和DH5α△ptsG明显不同,其最高菌密度是DH5α和DH5α△ptsG的近2倍。而DH5α△ptsG生长行为与DH5α无明显差异。但在含1%葡萄糖的LB中,DH5α△ptsHIcrr和DH5α△ptsG均表现出生长优势,最高菌密度依次是DH5α的2.8倍、2倍;培养液中最终乙酸含量分别是DH5α的12.2%、47%。在M9修饰培养基中,DH5α△ptsHIcrr比生长速率(h-1)和比葡萄糖消耗速率(g·g-1·h-1)明显低于DH5α,并略低于DH5α△ptsG。结果说明,ptsHIcrr操纵子敲除菌改变了葡萄糖的代谢速率,并呈现与ptsG基因敲除菌不同的代谢特点。ptsG缺陷株有望用于高密度发酵;此外,DH5α△ptsHIcrr比葡萄糖消耗速率为后续进一步构建生产莽草酸及其他芳香族氨基酸工程菌株打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1 PTS 系统概述
• 1.1 功能型PTS 介导的葡萄糖转运
• 1.2 GalP 和Glk 介导葡萄糖转运途径
• 2 PTS 系统分子改造进展
• 2.1 ptsG 缺陷株及应用
• 2.2 ptsHIcrr 缺陷株及GalP 表达可控化
• 3 基因修饰研究进展
• 3.1 两步Red 重组技术
• 3.2 Cre/loxP 切除系统
• 3.3 RecA 重组、Red 和I-SceⅠ基因修饰技术机制
• 3.4 Red 同源重组系统的优化
• 3.5 Red 同源重组应用
• 4 本实验研究意义
• 参考文献
• 第二章 大肠杆菌ptsG 基因的快速敲除及敲除菌性能测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 打靶质粒pG 构建
• 2.2 ptsG 阳性敲除菌落PCR 鉴定
• 2.3 ptsG 阳性敲除菌的传代及分离
• 2.4 ptsG 敲除菌生长性能
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 E.coli ptsHIcrr 操纵子快速敲除及敲除菌性能测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果和分析
• 2.1 打靶质粒构建及ptsHIcrr 敲除菌
• 2.2 DH5α△ptsHIcrr、DH5α△ptsG 及DH5α生长代谢特征比较
• 2.3 EGFP 蛋白表达及分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 硕士研究生期间论文发表