南瓜矮化突变体cgα的遗传、生理生化及相关基因表达分析

论文摘要

南瓜（Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.）Duch.ex Poiret）植株的蔓一般较长,所需栽培空间大,而其矮化植株适合密集种植,易于栽培和管理,因而在生产应用上具有较大优势。为了全面认识南瓜蔓伸长发育的系统调控,揭示南瓜属植物矮化突变体产生的生理与分子机理,本研究以南瓜‘无蔓1号’自交后代中分离得到的纯合矮化突变体cga和及其野生型（长蔓株）为亲本,构建其杂交和回交后代,进行遗传学分析和石蜡切片观察,激素敏感性以及生理生化指标差异研究,同时利用cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技术对植株节间基因的表达差异进行研究,并采用RT-PCR（reverse transcriptase polymerase chain reaction）技术分析部分差异表达片段（transcriptderivedfragments,TDFs）在不同发育阶段的营养组织与生殖组织中的表达情况,进而采用同源扩增技术分离得到与蔓伸长相关基因。研究结果表明:（1）南瓜矮化突变体cga及其野生型生物学以及生殖特征比较表明,矮化与长蔓植株的生物学性状差异主要存在于主蔓长度、节间长度、节间数量和雄花数量等几个方面。同时,矮化植株始花期比长蔓植株缩短了8d。另外,两种不同生长类型的植株在叶片长度、叶片宽度、叶柄长度等方面无显著差异。F1植株的生物学性状研究结果表明,其各项生物学性状指标与矮生亲本植株接近。对cga的遗传学分析表明,其蔓生性状是由一对等位基因控制的,其中控制矮生性状的基因为显性（Bu）,控制蔓生性状的基因为隐性（bu）。cga及其野生型植株胚轴伸长速率测定以及胚轴和节间的细胞学观察结果表明,cga可能是由于细胞伸长受阻导致植株矮化。（2）使用4种不同浓度的植物激素(BR、IAA、GA3和GA4+7)对南瓜矮化突变体cga与野生型植株激素敏感性研究表明,4种植物激素均不能使cga植株的蔓长恢复至野生型植株水平。BR和IAA处理非但没有促进cga与野生型植株蔓伸长,反而在一定程度上对其伸长起到了抑制作用。cga与野生型植株对GA3和GA4+7均有敏感性,外源喷施GA3和GA4+7能够分别使cga植株的蔓长增加188.9%和529%,分别使野生型植株的蔓长增加155.9%和46.8%,因此,cga既不属于激素缺陷型也不属于激素不敏感型突变体。BR和IAA会稍微的抑制南瓜叶柄伸长。GA3和GA4+7能够促进矮化植株叶柄的伸长,但对长蔓植株叶柄伸长影响不大。（3）对南瓜矮化突变体cga及其野生型植株不同发育阶段的ROS代谢(O2-·和H2O2)、抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT、APX和POD）、POD同工酶和蛋白质谱带以及内源激素含量（GA3、GA4和IAA）分析表明,cga植株的O2-·含量在28d以后高于野生型植株;除了在32d存在差异之外,cga与野生型植株的H2O2含量在整个发育过程中不存在差异;cga植株CAT活性高于长蔓植株;在不同发育时期SOD活性不存在差异;APX活性在几乎整个发育阶段均存在差异,cga植株APX活性在24、28、32和36d高于野生型植株;POD活性研究结果表明,cga植株不同发育阶段节间和叶片POD活性高于野生型植株,而野生型植株拥有较高的根组织POD活性;cga与野生型植株叶片的POD活性要低于其节间和根;cga与野生型植株的根、叶片和节间均有典型特征的POD同工酶谱带;植株节间POD同工酶不仅在数量上存在差异,同时也在表达量上存在较大差异。此外,cga与野生型植株不同发育时期根和节间的可溶性总蛋白带型存在差异。利用ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）技术对cga与野生型植株内源激素分析表明,cga植株不同发育时期节间GA3、IAA和GA4含量均低于野生型植株;cga植株根和叶片的GA3含量也低于野生型植株。（4）运用cDNA-AFLP技术对南瓜矮化突变体cga与野生型植株蔓伸长相关基因进行差异表达分析,发现有57条TDFs,它们代表的基因分别涉及能量与代谢相关基因、未知功能蛋白、未知基因、植物抗性相关基因、细胞壁生物合成与修饰相关基因、信号传导相关基因和转录因子相关基因。选取其中6个差异片段进行了RT-PCR验证,有4个差异片段的表达模式与cDNA-AFLP分析结果一致。同时,上述4个阳性差异片段在在野生型不同组织中拥有不同的表达模式。（5）以cDNA-AFLP结果为基础,利用同源扩增技术,从南瓜矮化突变体cga的野生型植株中获得一个编码NADH脱氢酶的新基因,命名为Cucurbita moschata Bush related 1（CmBul）。该cDNA全长545bp,含有477bp的完整开放阅读框。CmBul在核苷酸水平上与甘蓝叶绿体NADH脱氢酶J亚基有99%的相似性。推导的CmBul氨基酸序列与拟南芥叶绿体NADH脱氢酶J亚基有99%的相似性。通过Prosite数据库查询,发现其存在许多结构域,其中主要包括1个呼吸链NADH脱氢酶30kDa亚信号,3个N端豆蔻酰化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点。RT-PCR分析结果表明,CmBul在胚轴和节间中表达量最高,同时其在处于伸长发育过程中的节间表达量要大于已经完成伸长发育的节间。CmBul可能在南瓜蔓伸长过程中发挥作用。

论文目录

• 致谢
• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 植物矮化突变体的获得
• 1.2 植物矮化突变体的遗传学研究
• 1.3 植物矮化突变体的解剖学研究
• 1.4 植物矮化突变体与植物激素之间的关系
• 1.4.1 植物矮化突变体的激素敏感性研究
• 1.4.2 植物矮化突变体与内源激素的关系
• 1.5 植物矮化突变体相关基因
• 1.5.1 与GA相关的植物矮化突变体相关基因
• 1.5.1.1 GA的生物合成
• 1.5.1.2 与GA缺陷型植物矮化突变体相关基因
• 1.5.1.3 与GA不敏感型植物矮化突变体相关基因
• 1.5.2 与BR相关的植物矮化突变体相关基因
• 1.5.3 其它植物矮化突变体相关基因
• 2 南瓜矮化突变体cga的遗传学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 1s、F₂和BC₁s的构建'>2.1.2 南瓜矮化突变体cga及其野生型、F₁s、F₂和BC₁s的构建
• 2.1.3 生物学性状测定
• 2.1.4 遗传学分析
• 2.1.5 胚轴伸长速率测定
• 2.1.6 细胞学观察
• 2.2 结果与分析
• 1s、F₂和BC₁s的获得'>2.2.1 南瓜矮化突变体cga及其野生型、F₁s、F₂和BC₁s的获得
• 2.2.2 南瓜矮化突变体cga及其野生型生物学性状的比较
• 2.2.3 南瓜矮化基因的遗传学分析
• 2.2.4 南瓜矮化突变体cga植株胚轴伸长速率小于其野生型植株
• 2.2.5 南瓜矮化突变体cga植株胚轴和节间细胞均小于长蔓植株
• 2.3 讨论
• 2.3.1 南瓜矮化突变体cga为单基因显性遗传
• 2.3.2 南瓜矮化突变体cga的产生可能是由于细胞伸长受阻所致
• 3 南瓜矮化突变体cga的激素敏感性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 激素处理
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 外源喷施BR不能促进南瓜蔓伸长
• 3.2.2 外源喷施IAA不能促进南瓜蔓伸长
• 3能够在一定程度上促进南瓜蔓的伸长'>3.2.3 外源喷施GA₃能够在一定程度上促进南瓜蔓的伸长
• 4+7能够在一定程度上促进南瓜蔓的伸长'>3.2.4 外源喷施GA₄₊₇能够在一定程度上促进南瓜蔓的伸长
• 3和GA₄₊₇对南瓜叶柄、叶片发育的影响'>3.2.5 外源喷施BR、IAA、GA₃和GA₄₊₇对南瓜叶柄、叶片发育的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 南瓜矮化突变体cga既不属于激素缺陷型也不属于激素不敏感型突变体
• 3.3.2 控制南瓜属植物蔓伸长的不同基因可能具有不同的激素敏感性
• 3.3.3 南瓜蔓伸长基因可能通过调节植物激素受体水平来调控蔓伸长
• 4 南瓜矮化突变体cga的生理生化特征分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 酶液的提取与抗氧化酶活性的测定
• 2^-·和H₂O₂含量测定'>4.1.3 O₂^-·和H₂O₂含量测定
• 4.1.4 内源激素含量的测定
• 4.1.4.1 主要试验试剂及其配制
• 4.1.4.2 样品中内源激素的提取与纯化
• 4.1.4.3 ELISA测定内源激素
• 4.1.5 SDS-PAGE分析
• 4.1.5.1 主要试验试剂及其配制
• 4.1.5.2 蛋白质提取及SDS-PAGE分析
• 4.1.6 POD同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 4.1.7 统计分析
• 4.2 结果与分析
• 2^-·和H₂O₂含量差异比较'>4.2.1 O₂^-·和H₂O₂含量差异比较
• 4.2.2 CAT、SOD和APX活性差异比较
• 4.2.3 POD活性及同工酶比较
• 4.2.4 可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析
• 3、GA₄、IAA含量差异比较'>4.2.5 内源GA₃、GA₄、IAA含量差异比较
• 4.3 讨论
• 2^-·和APX可能在南瓜蔓伸长过程中发挥负调节作用'>4.3.1 O₂^-·和APX可能在南瓜蔓伸长过程中发挥负调节作用
• 4.3.2 南瓜cga与其野生型的基因型差异影响POD活性及其同工酶的表达
• 4.3.3 南瓜cga与其野生型的基因型差异对其蛋白质表达谱带影响不大
• 4.3.4 Bu可能通过不同机制调控cga及其野生型内源激素含量
• 5 南瓜矮化突变体cga及其野生型植株基因差异表达的cDNA-AFLP分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 RNA的分离及检测
• 5.1.3 cDNA-AFLP技术
• 5.1.3.1 cDNA的合成
• 5.1.3.2 cDNA纯化
• 5.1.3.3 cDNA酶切
• 5.1.3.4 连接
• 5.1.3.5 模板预扩增
• 5.1.3.6 选择性扩增
• 5.1.3.7 测序胶电泳、染色
• 5.1.4 特异性片段克隆和序列分析
• 5.1.5 RT-PCR检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 提取的南瓜组织总RNA及合成的cDNA质量较高
• 5.2.2 南瓜矮化突变体cga与其野生型植株基因表达的cDNA-AFLP分析
• 5.2.3 南瓜蔓伸长相关基因的功能类群
• 5.2.4 部分南瓜蔓伸长相关基因表达模式的RT-PCR分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 cDNA-AFLP分析能够部分探明基因突变引起的下游基因的表达变化
• 5.3.2 克隆得到的差异片段可能代表着南瓜蔓伸长相关基因
• 5.3.3 cga可能与植物激素生物合成或信号传导受阻没有直接联系
• 6 南瓜蔓伸长相关基因CmBul的克隆和表达特征分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料与试剂
• 6.1.2 RNA的分离及检测
• 6.1.3 cDNA的合成
• 6.1.4 DNA提取
• 6.1.5 引物合成和PCR扩增
• 6.1.6 cDNA和DNA全长序列的扩增
• 6.1.7 PCR产物的克隆及测序
• 6.1.8 基因全长序列的特征分析
• 6.1.9 RT-PCR分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 差异片段A17T5-3的获得
• 6.2.2 CmBul的cDNA和DNA全长序列
• 6.2.3 CmBul基因的相似性
• 6.2.4 CmBul基因的基本特征
• 6.2.5 CmBul基因编码蛋白的二级结构
• 6.2.6 CmBul在南瓜不同器官中的表达特征
• 6.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文