胁迫诱导棉花microRNA的差异表达分析

论文摘要

MicroRNA （miRNA）是一类内源性的、非编码单链小RNA。近年来研究发现,miRNA作为基因表达中的一类负调控子,不仅在植物新陈代谢、器官发育及组织分化中起重要的作用,而且可以响应植物的生物和非生物逆境胁迫,在植物感受逆境胁迫而做出适应性调整的过程中发挥着重要的作用。因此,对胁迫诱导miRNA进行研究,有助于探明植物逆境适应反应的“成因机理”以及miRNA所介导的基因表达调控网络,为提高转基因植物抵抗胁迫的能力提供新的途径。本研究选用高盐和黄萎病两种代表性的环境胁迫（前者是非生物胁迫,后者是生物胁迫）对棉花进行胁迫处理,利用生物信息学预测和实验验证相结合的方法,鉴定了棉花中的miRNA,分析了胁迫诱导条件下棉花miRNA的差异表达情况,初步探讨了差异表达miRNA在抗逆反应中所起的作用,为阐明棉花耐盐和抗黄萎病的调控途径提供参考。本研究获得的主要结果如下:1.在miRBase数据库（Release 10.1）中筛选出保守的植物miRNA家族,并以它们的序列作为“种子序列”应用于同源搜索miRNA方法当中,在EST、GSS和Core-Nucleotide数据库中搜索预测miRNA,从而改进miRNA计算机预测方法。2.利用改进的miRNA计算机预测方法预测了棉花等作物中的miRNA。在预测的得到的棉花miRNA中,有2个来自于GSS序列,3个来自于Core-Nucleotide序列,其余的16个来自于EST序列。3.利用miRNA芯片验证以上预测得到的棉花miRNA,芯片杂交结果显示其中10个属于可检测miRNA。利用荧光定量PCR检测了miRNA在高盐胁迫条件下,两种棉花品系（耐盐品系山农91-11和盐敏感品系鲁棉6号）中的表达情况。结果显示:高盐胁迫条件下,miR156a、miR156d、miR156e和miR169在耐盐品系山农91-11中表达量下调,miR167a和miR399a表达量上调,而miR159在盐敏感品系鲁棉6号中表达量下调。4.利用生物信息学预测得到棉花miRNA的靶基因共23个,利用荧光定量PCR检测了5个靶基因的表达情况。结果显示:高盐胁迫条件下,SPL3,RNA helicase和HAP2在耐盐品系山农91-11中表达量上调,而ARF8和Ghi.6739表达量下调。5.以陆地棉-冀棉11（易感黄萎病）和海岛棉-海7124（抗黄萎病）为研究材料,分别建立了正常生长和黄萎病菌侵染条件下的四个小RNA库,然后利用高通量Solexa测序共获得68 970 173条小RNA序列;结合生物信息学分析得到215个棉花miRNA;不同样本间小RNA种类及数量差异显著,平均约有40%的Unique sRNA为样本特有sRNA。6.将四个小RNA库中miRNA数量归一化,比较miRNA表达量的差异。结果显示:在冀棉11中,38个miRNA在黄萎病菌侵染条件下表达量下调,15个miRNA表达量上调;在海7124中,24个miRNA在黄萎病菌侵染条件下表达量下调,15个miRNA表达量上调。此外,在正常生长和黄萎病菌侵染条件下,分别有54个和44个miRNA在两种棉花材料之间表达量有显著差异。生物信息学预测得到了63个miRNA的靶基因共161个,其中与胁迫、信号转导和防御密切相关的靶mRNA序列共25个。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 miRNA 的产生
• 1.2 miRNA 的作用方式
• 1.3 与植物生长发育相关的miRNA
• 1.3.1 miRNA 参与植物开花及花器官发育
• 1.3.2 miRNA 对植物叶和茎发育的影响
• 1.3.3 miRNA 对根发育的影响
• 1.3.4 miRNA 参与发育时序调控及其它调控作用
• 1.4 与植物逆境胁迫相关的miRNA
• 1.4.1 miRNA 与植物非生物胁迫
• 1.4.1.1 miRNA 与植物营养胁迫
• 1.4.1.2 miRNA 与低温胁迫
• 1.4.1.3 miRNA 与干旱胁迫
• 1.4.1.4 miRNA 与其它非生物胁迫
• 1.4.2 miRNA 与植物生物胁迫
• 1.5 miRNA 的研究方法
• 1.5.1 miRNA 的发现方法
• 1.5.1.1 miRNA 文库的构建、克隆和测序
• 1.5.1.2 计算机预测法
• 1.5.2 miRNA 靶基因的预测与验证
• 1.6 展望
• 1.7 本研究的立题依据与目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料与病原菌
• 2.1.2 酶与各种生化试剂
• 2.1.3 试验用探针序列和引物序列
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 生物信息分析所用的数据库
• 2.1.6 生物信息分析所用的分析软件
• 2.1.7 miRNA 的预测标准
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 棉苗培养与盐胁迫处理
• 2.2.2 棉苗培养与病菌接种
• 2.2.3 棉花总RNA 的提取
• 2.2.4 miRNA 芯片试验
• 2.2.5 Northern blot 检测miRNA 的表达
• 2.2.6 RT-PCR 定量检测
• 2.2.7 小分子RNA 文库的构建
• 2.2.8 小分子RNA 的测序
• 2.2.9 小分子RNA 文库的生物信息学分析
• 2.2.10 miRNA 靶基因的预测方法
• 3 结果与分析
• 3.1 植物miRNA 预测方法的改进和棉花miRNA 的预测
• 3.1.1 植物miRNA 的保守性分析
• 3.1.2 改进植物miRNA 的预测方法
• 3.1.3 改进植物miRNA 的预测方法的应用
• 3.2 盐诱导棉花miRNA 的差异表达分析
• 3.2.1 棉花miRNA 芯片的杂交结果
• 3.2.2 利用Northern blot 验证盐诱导表达的棉花miRNA 家族
• 3.2.3 利用RT-PCR 验证盐诱导表达的棉花miRNA
• 3.2.4 盐诱导条件下miRNA 靶基因的表达情况
• 3.3 黄萎病菌侵染条件下棉花miRNA 的差异表达分析
• 3.3.1 小RNA 测序的初步分析结果
• 3.3.2 棉花miRNA 的鉴定
• 3.3.3 黄萎病菌诱导棉花miRNA 的表达
• 3.3.4 黄萎病菌侵染条件下,差异表达 miRNA 的靶基因
• 4 讨论
• 4.1 同源搜索miRNA 方法的改进
• 4.2 基因芯片检测miRNA 的表达
• 4.3 高通量测序技术为小分子RNA 的研究提供了强有力的平台
• 4.4 测序结果中体现了丰富的miRNA 信息
• 4.5 miRNA 在耐盐过程中的作用
• 4.6 miRNA 的特异性表达
• 4.7 miRNA 在抗黄萎病中的作用
• 4.8 进一步研究设想
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 博士学位论文内容简介及自评