氧化葡萄糖酸杆菌中两个NADPH依赖的氧化还原酶基因的克隆表达及其酶学性质分析

论文摘要

氧化葡萄糖酸杆菌不完全氧化碳源底物的能力使其具有巨大的应用价值。随着全基因组序列的公布,对于该菌的分子生物学研究有了快速发展。本研究发现氧化葡萄糖酸杆菌细胞质中两个未知功能的基因（gox0644和gox1615）与醛酮还原酶家族的成员具有60-70%的序列同源性,含有醛酮还原酶家族高度保守的天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-组氨酸构成的催化四聚体。通过构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达可溶性的蛋白,Ni柱纯化得到单一条带的重组蛋白,分子量分别约为32KDa和50KDa。针对所获得的重组酶蛋白的底物谱研究表明,gox0644和gox1615都以NADPH为辅酶,都对醛具有较高的还原活性。其中GOX0644对于芳香醛底物的活性高于脂肪醛,且对氯取代的苯甲醛好于硝基取代的苯甲醛,对单糖与酮底物反应活性微弱,基本没有醇的氧化活性,确定GOX0644为NADPH依赖的醛还原酶（Aldehyde reductases）。GOX1615更适合于催化脂肪醛的还原,对DL-甘油醛反应活性最高,底物特异性与Hypocrea. Jecorina的NADP+依赖的甘油脱氢酶有很大的相似性,把它归为甘油脱氢酶。实验还测定了它们的最适反应pH、最适反应温度、酸碱稳定性、热稳定性及相关酶动力学参数。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 氧化葡萄糖酸杆菌的特性
• 1.2 氧化葡萄糖酸杆菌的应用
• 1.2.1 羟基丙酮和甘油酸生产
• 1.2.2 D-塔格糖的生产
• 1.2.3 莽草素的生产
• 1.2.4 1-脱氧野尻霉素和米格列醇的合成
• 1.2.5 氧化葡萄糖酸杆菌的其它应用
• 1.3 氧化葡萄糖酸杆菌的酶学和分子生物学研究
• 1.3.1 氧化葡萄糖酸杆菌基因组一般特征
• 1.3.2 基因组学水平分析G.oxydans中间代谢
• 1.3.3 氧化葡萄糖酸杆菌酶学研究
• 1.3.4 氧化葡萄糖酸杆菌酶基因克隆常用手段
• 1.4 醛酮还原酶家族概述
• 1.5 本课题的研究意义与内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 内切酶、DNA分子标准、蛋白质分子标准及试剂盒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基配方
• 2.1.5 主要仪器及设备
• 2.1.6 应用软件及程序
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物信息学分析
• 2.2.2 基因克隆
• 2.2.3 重组蛋白表达及纯化
• 2.2.4 重组蛋白浓度的测定
• 2.2.5 酶学性质分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 生物信息学分析
• 3.1.1 序列基本信息
• 3.1.2 基因序列同源性比对（BLAST）
• 3.2 基因的克隆
• 3.2.1 氧化葡萄糖酸杆菌M5基因组DNA的提取
• 3.2.2 PCR扩增产物的电泳鉴定
• 3.2.3 重组质粒的构建与酶切鉴定
• 3.2.4 Gox0644和gox1615全基因序列及蛋白序列
• 3.3 GOX0644和GOX1615重组蛋白在大肠杆菌表达与纯化
• 3.4 重组蛋白浓度测定
• 3.5 酶学性质分析
• 3.5.1 底物谱研究
• 3.5.2 最适pH和最适温度的测定
• 3.5.3 酶动力学研究
• 3.5.4 酶热稳定性和酸碱稳定性
• 3.5.5 金属离子对GOX0644活性的影响
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢