Complexin与SNARE复合体之间的相互作用及其功能的研究

论文摘要

Complexin是一个在快速神经递质释放过程中通过结合SNARE复合体发挥重要作用的高度亲水的小分子蛋白。但是关于complexin蛋白两侧区域在结合SNARE复合体时有何作用以及complexin蛋白在SNARE复合体形成过程中有什么作用目前还没有报道,此外,高浓度的complexin蛋白抑制递质释放的分子机理目前也不清楚。本文重点研究了complexin与SNARE复合体之间结合的特性以及高浓度的complexin抑制递质释放的分子机理。本文首先利用pull-down和荧光共振能量转移的方法分析complexin蛋白两侧区域对其结合SNARE复合体的影响。结果显示,complexin的71-77片断是其结合SNARE复合体所必需的;而且突变这个片断上的73、74、75位的带正电荷的赖氨酸能抑制complexin与SNARE复合体的结合能力,这说明complexin的71-77片断可能通过静电作用影响complexin与SNARE复合体之间的结合。其次,为了分析complexin在SNARE复合体形成过程中的作用,本文构建了一系列SNARE复合体的突变体来模拟不同组装程度的SNARE复合体的中间体。证明了complexin能与不同组装程度的SNARE复合体的中间体结合;而且complexin的结合能力与SNARE复合体的组装程度成正相关。这说明,complexin在SNARE复合体形成早期就开始结合SNARE复合体,随着SNARE复合体组装完成,complexin与其结合也就越紧密。论文第三部分构建并筛选了能稳定表达complexin的PC12细胞系,以此来研究complexin的功能。证明了在PC12细胞中过量表达complexin能抑制SNARE复合体的再循环,从而导致细胞中RRP囊泡的减少,最终反映在递质释放的减少。这表明,complexin除了公认的将囊泡停留在半融合状态外,还参与SNARE复合体的再循环。以上结果揭示了complexin如何结合SNARE复合体以及它在SNARE复合体的再循环过程中的作用,这有助于进一步理解complexin在递质释放过程中的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 神经元和突触囊泡
• 1.2 突触囊泡的循环
• 1.3 突触囊泡与突触前膜融合的机理-SNARE 假说
• 1.4 参与囊泡融合的几种重要蛋白
• 1.4.1 SNARE 蛋白组分及其结构和功能
• 1.4.1.1 SNARE 蛋白的结构
• 1.4.1.2 SNARE 复合体的形成和解聚
• 1.4.1.3 SNARE 蛋白与膜
• 1.4.2 Synaptotagmin 蛋白的结构和功能
• 1.4.2.1 Synaptotagmin 的发现和结构
• 1.4.2.2 Synaptotagmin 的功能
• 1.4.3 nSec1/Munc18（SM 蛋白）的结构和功能
• 1.4.4 Ra63 的结构和功能
• 1.4.5 α-SNAP 和NSF 蛋白的结构和功能
• 1.4.6 Complexin 蛋白的结构和功能
• 1.4.6.1 Complexin 蛋白的发现及分布
• 1.4.6.2 Complexin 蛋白结构特点
• 1.4.6.3 Complexin 蛋白的功能特征
• 1.4.6.4 与complexin 相关的疾病
• 1.5 本文研究内容和意义
• 第2章 COMPLEXIN 上参与结合SNARE 复合体的新位点
• 2.1 不同来源的COMPLEXIN氨基酸序列对比
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果
• 2.2 不同突变体对COMPLEXIN 结合SNARE 复合体的影响
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 构建质粒
• 2.2.2.2 蛋白的表达和纯化
• 2.2.2.3 SNARE 复合体的制备
• 2.2.2.4 Pull-down 检测
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.3.1 蛋白样品的制备
• 2.2.3.2 不同complexin 或其突变体结合SNARE 复合体的分析
• 2.3 突变73、74、75 位的赖氨酸对COMPLEXIN结合SNARE 复合体的影响
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 构建质粒
• 2.3.2.2 蛋白的表达和纯化
• 2.3.2.3 Pull-down 检测
• 2.3.2.4 荧光共振能量转移
• 2.3.3 实验结果
• 2.3.3.1 突变CPXII 77 末端的三个保守的赖氨酸对CPXII 77 结合SNARE的影响
• 2.4 N 端缺失对COMPLEXIN结合SNARE 复合体的影响
• 2.4.1 实验材料
• 2.4.2 实验方法
• 2.4.3 实验结果
• 2.5 本章小结与讨论
• 第3章 COMPLEXIN 与不同组装程度的SNARE 复合体之间的结合
• 3.1 制备一系列模拟处于部分组装的SNARE 复合体的突变体
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 构建质粒
• 3.1.2.2 蛋白的表达和纯化
• 3.1.2.3 SNARE 复合体的突变体的制备
• 3.1.2.4 SNARE 复合体的突变体在不同温度下的SDS 抗性分析
• 3.1.2.5 圆二色光谱分析
• 3.1.3 实验结果
• 3.1.3.1 由SNAP-25 突变体组成的SNARE 复合体的突变体的制备
• 3.1.3.2 SNARE 突变体的稳定性表征
• 3.2 分析COMPLEXIN是否能与部分组装的SNARE 复合体结合
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 质粒的构建
• 3.2.2.2 蛋白的表达和纯化
• 3.2.2.3 PC12 细胞的培养、转染以及细胞裂解液的提取
• 3.2.2.4 Pull-down 检测
• 3.2.3 实验结果
• 3.2.3.1 Complexin 与部分组装的SNARE 复合体结合的分析
• 3.2.3.2 Complexin 与部分组装SNARE 复合体的结合不受SNARE 蛋白的翻译后修饰影响
• 3.3 COMPLEXIN 与部分组装的SNARE 复合体在细胞膜上部分共定位
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 真核表达融合质粒的构建
• 3.3.2.2 细胞培养和转染
• 3.3.2.3 用共聚焦荧光显微镜观察蛋白的共定位
• 3.3.3 实验结果
• 3.3.3.1 Complexin 与部分组装的SNARE 复合体在细胞膜上部分共定位
• 3.4 COMPLEXIN 与不同组装情度的SNARE 复合体结合能力的比较
• 3.4.1 实验材料
• 3.4.2 实验方法
• 3.4.2.1 荧光共振能量转移
• 3.4.3 实验结果
• 3.4.3.1 Complexin 结合SNARE 复合体的能力与SNARE 复合体的组装程度成正相关
• 3.5 本章小结与讨论
• 第4章 过量表达COMPLEXIN 抑制递质释放的机理
• 4.1 稳定表达COMPLEXIN的PC12 细胞系的建立
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 真核表达质粒的构建
• 4.1.2.2 PC12 细胞的培养和转染
• 4.1.2.3 稳定表达complexin 的PC12 细胞系的筛选和鉴定
• 4.1.2.4 检测在稳定表达细胞系中参与递质释放有关的蛋白的表达水平
• 4.1.2.5 多克隆抗血清的制备
• 4.1.3 实验结果
• 4.1.3.1 稳定表达complexin 的PC12 细胞系的建立
• 4.1.3.2 稳定表达complexin 对其他参与递质释放的蛋白表达水平的影响
• 4.2 分析过量表达COMPLEXIN 对递质释放的影响
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 3H]多巴胺释放的检测'>4.2.2.1 [7,8,³H]多巴胺释放的检测
• 4.2.2.2 细胞中钙水平变化的检测
• 4.2.3 实验结果
• 4.2.3.1 Complexin 过量表达对递质释放的影响
• 4.2.3.2 Complexin 过量表达对可释放囊泡库大小的影响
• 4.3 过量表达COMPLEXIN对大致密囊泡的数目和分布的影响
• 4.3.1 实验材料
• 4.3.2 实验方法
• 4.3.2.1 电镜切片的制备和观察
• 4.3.3 实验结果
• 4.3.3.1 过量表达complexin不影响PC12细胞中大致密囊泡的数目和分布
• 4.4 过量表达COMPLEXIN对细胞中SNARE 复合体循环的影响
• 4.4.1 实验材料
• 4.4.2 实验方法
• 4.4.2.1 细胞膜组分的制备
• 4.4.3 实验结果
• 4.4.3.1 过量表达complexin 导致PC12 细胞中SNARE 复合体的积累
• 4.5 本章小结与讨论
• 2AB）的聚集'>第5章 利用荧光共振能量转移来研究SYNAPTOTAGMIN 胞质部分（C₂AB）的聚集
• 2AB 的聚合'>5.1 在体外用荧光共振能量转移来分析C₂AB 的聚合
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 2AB 真核表达质粒的构建'>5.1.2.1 N 端融合CFP 或YFP 的C₂AB 真核表达质粒的构建
• 5.1.2.2 T293 细胞的培养和转染
• 5.1.2.3 转染后的细胞膜组分和上清组分的制备分离
• 5.1.2.4 荧光共振能量转移的检测
• 5.1.2.5 荧光数据的处理
• 5.1.3 实验结果
• 5.1.3.1 融合的CFP-YFP 能产生很强的FRET 信号
• 5.1.3.2 C2AB 在有钙离子和膜存在的条件下能产生FRET 信号
• 2的含量能影响C₂AB 膜上的聚合'>5.1.3.3 膜上胆固醇和PIP₂的含量能影响C₂AB 膜上的聚合
• 2AB 的聚合'>5.2 在细胞水平上用荧光共振能量转移来研究C₂AB 的聚合
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 细胞的培养和转染
• 2AB 间的FRET'>5.2.2.2 用荧光显微镜检测C₂AB 间的FRET
• 5.2.3 实验结果
• 5.2.3.1 CFP-YFP 融合蛋白在细胞中能产生很强的FRET 信号
• 2AB 在细胞膜上能发生共振能量转移'>5.2.3.2 C₂AB 在细胞膜上能发生共振能量转移
• 5.3 本章小结与讨论
• 第6章 结论
• 6.1 论文总结
• 6.2 论文工作中的问题以及展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果