玉米自交系87-1BAC文库的构建及Cms-C恢复基因Rf4区域BAC克隆的筛选

论文摘要

玉米是世界上三大粮食作物之一,在社会发展中占有重要地位。杂种优势的应用使得玉米产量有了大幅的提高,而细胞质雄性不育（CMS）的利用则是实现杂种优势利用的一条有效途径。雄性不育的利用在降低生产成本,提高种子纯度等方面起到了积极的作用自从首次在玉米中发现不育系以来,科学家们主要从事了雄性不育育性恢复基因的分子机制的研究,并且至少发现了5个控制雄性不育育性恢复的基因。Duvick等（1961）把Rf1定位于第3号染色体短臂端;Snyder等（1969）把Rf2定位于第9号染色体靠近Wx基因座位附近区域;Cui等（1996）用转座子标签法克隆得到Rf2基因;Langhnan等（1978）把Rf3定位于第2号染色体的长臂上;Josephson等（1978）首次把恢复基因Rf4定位在8号染色体上;本课题组2001年把Rf5定位于第5染色体上;尽管这些基因都很重要,除Rf2以外其它均没被克隆。在前人研究的基础上,本课题组把恢复基因Rf4精细定位于X-21-1与X-33两个标记之间,根据测序结果,这两个标记之间的物理距离约为0.05MB。本研究以含有恢复基因Rf4的玉米优良自交系87-1为材料,培养玉米黄化苗,用Zhang H B的方法提取基因组DNA,用限制性内切酶HindIII部分酶切提取的基因组DNA,回收100kb以上的酶切片段,然后与pIndigoBAC-5载体进行连接,通过电击转化将连接产物导入到大肠杆菌DH10B菌株的感受态细胞中,每次转化获得500—5,000个BAC克隆。构建的BAC文库约有214,300个克隆。该文库以混合的形式保存。把每一块培养皿上的克隆收集到一个离心管中,每个离心管相当于一个亚池,共得到1,296个亚池,每个亚池包含100—500个不等的BAC单克隆;每81个亚池混合成一个超级池,共得到16个超级池。通过对随机选取的100个BAC克隆插入片段的分析表明:该文库平均插入片段约100kb,空载率5%,约覆盖了约10倍的玉米基因组。随后,利用X-21-1和X-33两对引物做探针筛选到1个覆盖了整个Rf4定位区间的BAC克隆。本研究构建了玉米自交系87-1BAC文库,不仅能为恢复基因Rf4的图位克隆以及生物学研究奠定基础,并且能够为基因组序列测定、物理作图和其它重要基因的克隆提供一个平台。研究玉米质核互作雄性不育,能够进一步的明确雄性不育的败育机理、探明细胞质雄性不育系的质核互作关系以及细胞质雄性不育的核恢复基因的作用机理等,从而为选育优良不育系、相对应的保持系和相对应的恢复系提供理论支持。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 玉米生产概况和我国玉米育种生产所面临的问题
• 1.2 分子育种技术在玉米育种工作中的应用
• 1.3 细菌人工染色体的研究和应用
• 1.3.1 细菌人工染色体的构建和发展
• 1.3.2 细菌人工染色体的应用
• 1.3.2.1 基因的图位克隆
• 1.3.2.2 基因组物理图谱构建
• 1.3.2.3 基因组测序
• 1.3.2.4 基因组或特异染色体文库的构建
• 1.3.2.5 BAC-FISH 的应用
• 1.3.2.6 遗传转化
• 2. 引言
• 2.1 技术路线
• 3. 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 高纯度、高分子量细胞核DNA 的制备
• 3.2.1.1 细胞核的分离
• 3.2.1.2 胶块的制备
• 3.2.1.3 少量酶切寻找最佳酶切条件
• 3.2.1.4 基因组DNA 大量酶切
• 3.2.1.5 处理透析袋
• 3.2.1.6 洗脱大片段DNA
• 3.2.1.7 DNA 片段与载体连接
• 3.2.1.8 连接产物的脱盐
• 3.2.1.9 连接产物的电击转化
• 3.2.1.10 BAC 文库的保存
• 3.2.1.11 BAC 文库的质量检测
• 3.2.1.12 BAC 混合池的制备
• 3.3 恢复基因Rf4 区域BAC 克隆的筛选
• 3.3.1 玉米自交系87-1 BAC 混合池
• 3.3.2 PCR 反应体系及循环参数
• 3.3.3 对筛出的克隆进行长度鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 高质量玉米自交系87-1 基因组DNA 胶块的制备
• 3.4.2 部分酶切条件的确定
• 3.4.3 大片段DNA 的回收
• 3.4.4 连接转化
• 3.4.5 BAC 文库的质量检测
• 3.4.6 BAC 混合池的制备
• 3.4.7 玉米恢复基因Rf4 位点阳性BAC 克隆的筛选
• 4. 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 部分酶切条件的确定
• 4.1.2 高分子量基因组DNA 片段的获得
• 4.1.3 影响转化效率的因素
• 4.1.4 PCR 筛选的特点
• 4.1.5 PCR 筛选引物的来源
• 4.2 结论
• 4.2.1 玉米自交系87-1BAC 文库的构建
• 4.2.2 玉米恢复基因Rf4 区域BAC 克隆的筛选
• 参考文献
• 附录
• Abstract