大肠杆菌中国分离株质粒介导的喹诺酮类药物耐药性的流行特征

论文摘要

全球革兰氏阴性菌喹诺酮类药物耐药不断出现,而传统意义上认为的喹诺酮类药物耐药仅能通过突变或者垂直传播不能完全解释实际存在的高耐药突变率以及喹诺酮类药物耐药与其它抗生素耐药的强烈相关性,近期研究发现的质粒上携带的可水平传播的喹诺酮类药物耐药基因似乎解释了这种现象。目前已报道了三种不同类型的质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制,并且在不同质粒环境和细菌种属中获得了全球范围内的广泛传播。第一种机制是Qnr介导的,目前已经命名的等位体有QnrA、QnrS、QnrB、QnrC、QnrD,第二种是喹诺酮外排机制,这种流行的染色体编码的耐药机制,也被发现由质粒上的QepA及OqxAB介导。另一种为Aac（6’）-Ib-cr,它是氨基糖苷乙酰转移酶的变异体,可以降低结构中含有哌嗪环氨基氮的氟喹诺酮类药物的活性。这些机制虽然仅介导低水平的喹诺酮耐药,但在体外治疗水平的喹诺酮类药物浓度下可有助于筛选出高水平的耐药菌株。为了解质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在我国的流行传播特点,本研究以大肠杆菌为模式菌,调查质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在不同源菌株中的流行及分布情况,通过质粒接合实验获得不同质粒介导的喹诺酮类耐药基因阳性接合子并对其喹诺酮类药物的最小抑菌浓度及其它类抗生素的多重耐药表型进行测定,分析PMQR基因对喹诺酮类药物MIC值的影响以及其同时转移的其它类型抗生素耐药基因；对某养殖场qnrS基因进行跟踪监测,以了解基因的流行分布及消长情况,对不同来源qnrS阳性菌株进行遗传关系分析,同时对qnrS阳性质粒大小进行初步鉴定,以了解qnrS基因的传播方式。1.不同源大肠杆菌分离株质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的流行水平本研究通过PCR和测序方法研究质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因（qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, qepA, oqxAB和aac（6’）-Ib-cr）在1993-2010年间不同来源（人源、动物源及环境源）的大肠杆菌中国分离株中的流行及分布情况。在1022株细菌中,共检测到281株PMQR阳性菌株,阳性率为27.5%。PMQR基因在环境源菌株中流行率最高（36.4%）,其次为动物源菌株（32.9%）和人源菌株（14.3%）。qnr, qepA, oqxAB和aac（6’）-Ib-cr的流行率分别为5.7%（58株）,2.6%（27株）,20.2%（206株）和4.9%（50株）,未检测到qnrC和qnrD阳性菌株。其中qnr基因亚型包括qnrA1（1株）,qnrA3（3株）,qnrB2（1株）,qnrB4（1株）,qnrB9（7株）,qnrB10（2株）,qnrS1（35株）和qnrS2（8株）。首次在鸭源、鹅源菌株中检测到oqxAB基因。在机体内分离株中,PMQR基因在动物源肠道内菌株中的基因检出率为45.6%,显著高于肠道外分离株（23.7%）,oqxAB在动物源菌株中的流行率为27.0%（181/671）显著高于人源菌株（5.2%,16/307）（P<0.005）为最流行的PMQR基因。在PMQR阳性菌株中,环境源菌株PMQR基因双阳性或三阳性率（68.8%）显著高于机体内菌株（15.1%）,而在分离于动物源的菌株中,肠道内阳性菌株的基因双阳性或三阳性率为24.8%（32/129）显著高于肠道外菌株（6.5%,6/92）,说明环境中及动物肠道内菌株可能作为PMQR基因的储存库,在PMQR基因的传播中发挥重要的作用。种系发育种群表明,PMQR基因阳性菌株主要属于A和B1亚群。所有供体菌对美罗培南（碳青霉烯类）均表现敏感,而对其余9大类抗生素可产生耐药。除磷霉素和呋喃妥因这两种抗生素外,其余7类抗生素耐药基因均可随PMQR基因一起转移。PMQR基因的转移可使接合子对喹诺酮类药物的MIC值不同程度的升高。qnr基因对喹诺酮类药物MIC值影响大于其它类型耐药基因,不同作用机制的PMQR基因对喹诺酮MIC值的影响具有加和作用。染色体突变的累加是喹诺酮类药物耐药的主要决定因素,而对于喹乙醇这种喹喔啉类药物来说,染色体突变对它的MIC值影响不大,oqxAB基因是决定其耐药性的主要因素。2.qnrS基因在分离株中的流行传播特点选择qnrS基因为研究对象,通过对某养殖场不同来源样品进行细菌的分离,监测基因的流行水平、分布特点和变化趋势。共采集545份不同来源样品（包括鸡、鸭、鹅、污水、饮用水、泥沙、灰尘及饲料）,分离得到379株细菌。各个来源的菌株中均可检出qnrS阳性细菌,该养殖场存在两种亚型的qnrS基因流行。环境源菌株qnrS的阳性率为29.2%,显著高于禽源菌株基因检出率（13.4%）,新进的小鸡可迅速从养殖场其它源菌株中获得qnrS阳性基因并且在鸡群中流行。通过对养殖场qnrS阳性株进行脉冲场凝胶电泳分析显示分离自相同养殖场的大部分菌株相互之间的遗传关系较远,但也有显示相同带型的不同源菌株；对全国范围内的qnrS菌株分析也得到相似结论,即大部分菌株的亲缘关系较远,但在某些养殖场内也存在阳性菌株的克隆传播。通过对质粒大小鉴定可知,不同qnrS阳性质粒大小从30kb-300kb不等,表现出丰富的多样性。总之,qnrS基因在小范围内可进行接触及食物链等方式进行克隆传播,但主要是通过质粒播散或者通过整合子等水平传播模式进行传播流行。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 综述 质粒介导的喹诺酮类药物耐药研究进展
• 1 Qnr蛋白及其对喹诺酮类药物耐药的作用
• 1.1 Qnr蛋白的结构
• 1.2 Qnr蛋白对喹诺酮类药物耐药的作用
• 2 氨基糖苷乙酰转移酶Aac（6’）-Ib-cr
• 3 外排泵QepA及OqxAB
• 4 质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的流行病学
• 参考文献
• 第一章 不同源大肠杆菌分离株质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的流行水平
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 PCR引物设计与合成
• 2.2 PCR反应
• 2.3 aac（6’）-Ib-cr基因的酶切鉴定
• 2.4 DNA测序
• 2.5 PMQR基因阳性菌株种系发生群测定
• 2.6 PMQR基因阳性菌株质粒接合实验
• 2.7 受、供体菌及接合子的药敏纸片实验
• 2.8 受、供体菌及接合子的MIC实验
• 2.9 供体菌的染色体喹诺酮类药物耐药决定区gyrA、parC的测定
• 3 结果
• 3.1 质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因检测结果
• 3.2 DNA测序结果
• 3.3 PMQR基因阳性菌株种系发生群测定结果
• 3.4 PMQR基因阳性菌株质粒接合实验结果
• 3.5 受、供体菌及接合子的药敏纸片实验结果
• 3.6 受、供体菌及接合子的MIC实验结果
• 3.7 供体菌的染色体喹诺酮类药物耐药决定区gyrA、parC的测定结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 qnrS基因在分离株中的流行传播特点
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 某养殖场qnrS耐药基因的跟踪监测
• 2.2 qnrS阳性菌株脉冲场凝胶电泳分析
• 2.3 qnrS阳性接合子质粒大小鉴定
• 2.4 qnrS阳性接合子质粒Southern blotting验证
• 3 结果
• 3.1 qnrS耐药基因阳性养殖场菌株检测结果
• 3.2 qnrS阳性菌遗传进化关系分析
• 3.3 qnrS阳性菌株质粒大小鉴定
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文