当归抽薹植株的生理生化特征及DDRT-PCR分析

论文摘要

当归[Angelica sinensis （Oliv.） Diels]为伞形科当归属多年生草本药用植物,具有补血和血、调经止痛、润燥滑肠等功效。甘肃岷山北麓海拔在2000-2800 m的高寒阴湿山区（岷县、宕县、漳县、渭源、宕昌等）是中国当归最集中的产区,平均每年的种植面积约为20000 hm2,年产量约为6500 t,分别占全国当归栽培总面积、总产量的70%和90%以上,成为当地经济的支柱产业,对贫困地区农民脱贫致富起到了重要作用。但当归生产上存在早期抽薹的问题,一般抽薹发生率达30%～50%,有时可达90%以上,早期抽薹植株完全丧失其药用价值,对生产危害极大。因此,通过对当归抽薹植株的生理生化特征及DDRT-PCR分析,了解当归抽薹过程中所发生的生理生化变化及差异基因表达,为预防当归抽薹提供理论依据。通过分析抽薹与未抽薹当归植株在不同生长发育时期的生理生化特征得出,在抽薹前10 d,未抽薹植株的游离氨基酸、POD活性和PPO活性分别为7.53 mg/（g FW）、0.097ΔA470/ （min·g FW）、0.087ΔA410/（min·g FW）,比抽薹植株低1.3 mg/（g FW）、0.02ΔA470/ （min·g FW）、0.014ΔA410/（min·g FW）,抽薹植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量分别为4.63%和0.94%,比未抽薹植株高2.2%和0.5%。在抽薹期,未抽薹植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量较高,而抽薹植株的游离氨基酸含量、PPO活性和POD活性较高。说明当归抽薹过程是在各种代谢因子调控并进行一系列复杂的生理生化反应的复杂的生理发育过程。通过提取抽薹期抽薹与未抽薹当归植株叶片总RNA,采用DDRT-PCR技术分析抽薹当归差异基因的表达,并对影响DDRT-PCR技术PCR扩增的各种反应参数的优化,最终确立适合于当归PCR扩增体系及扩增程序。对DDRT-PCR技术扩增并回收成功8条差异条带,测序和blast比对分析发现,其中部分基因与白菜（Brassica rapa pekinensi）和紫花地丁（Viola philippica Car）的18SRNA、芜青（B.rapa chloroplast）叶绿体petA基因、拟南芥（Arabidopsis thaliana）mRNA（CID12）基因及与拟南芥花芽分化有关的GSLTFB95ZF12基因相似度高,但这些基因是否与当归抽薹特性相关,还需进一步克隆全序列的cDNA及功能鉴定。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• 前言
• Ⅰ 文献综述
• 1.1 当归的生长周期和“早期抽薹“现象
• 1.2 植物发生早抽薹现象的内因
• 1.2.1 遗传因素
• 1.2.2 植物的内源激素对早抽薹的影响
• 1.2.3 各种代谢物质对抽薹的影响
• 1.2.4 有关酶活性对抽薹的影响
• 1.3 植物发生早抽薹现象的外因
• 1.3.1 温度
• 1.3.2 光照
• 1.3.3 营养条件
• 1.3.4 气候及水分等因素
• 1.4 目前防治当归抽薹的主要措施
• 1.4.1 育苗过程中种子的选择
• 1.4.2 当归种植过程中播种期及种苗的选择
• 1.4.3 当归栽培条件及种植密度对防治早抽薹的作用
• 1.4.4 激素处理对防治当归抽薹的作用
• 1.5 DDRT-PCR 在筛选植物基因差异表达中的应用
• 1.5.1 研究植物基因差异表达的方法
• 1.5.2 DDRT-PCR 技术的原理及应用
• Ⅱ 本研究的目的和意义
• Ⅲ 技术路线图
• Ⅳ 材料与方法
• 4.1 材料
• 4.2 实验主要药品配置
• 4.3 实验仪器设备
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 可溶性糖含量测定
• 4.4.2 游离氨基酸含量的测定
• 4.4.3 过氧化物酶（POD）活性测定
• 4.4.4 多酚氧化酶（PPO）活性测定
• 4.4.5 当归叶片中可溶性蛋白含量的测定
• 4.4.6 当归中总RNA 的提取
• 4.4.7 改良CTAB 法提取
• 4.4.8 异硫酸氰胍法
• 4.4.9 TIANGEN 的RNAsimple Total RNA Kit 总RNA 提取试剂盒
• 4.4.10 RNA 的纯化
• 4.4.11 RNA 的反转录
• 4.4.12 DDRT-PCR 反应各参数的优化
• 4.4.13 DDRT-PCR 所用的引物
• 4.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.5.1 玻璃板的准备
• 4.5.2 变性聚丙烯酞胺凝胶配置
• 4.5.3 PCR 产物聚丙烯凝胶电泳分离
• 4.5.4 凝胶染色
• 4.5.5 DNA 差异条带回收
• 4.5.6 差异条带的二次扩增
• Ⅴ 结果分析
• 5.1 当归抽薹植株生理生化特征分析
• 5.1.1 当归抽薹过程中可溶性糖含量变化
• 5.1.2 当归抽薹过程中游离氨基酸含量的变化
• 5.1.3 当归抽薹过程中可溶性蛋白含量的变化
• 5.1.4 当归抽薹过程中POD 活性变化
• 5.1.5 当归抽薹过程中PPO 活性变化
• 5.2 当归DDRT-PCR 分析体系的建立
• 5.2.1 不同方法提取当归叶片中总RNA 的提取效果
• 5.2.2 PCR 扩增体系的优化
• 5.2.3 引物筛选及cDNA 扩增结果
• 5.3 当归早期抽薹与未抽薹性状的差异cDNA 片段筛选
• 5.3.1 cDNA-PCR 扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 5.3.2 cDNA 差异条带回收
• 5.4 当归早期抽薹与不抽薹性状的差异cDNA 片段的序列及分析
• Ⅵ 讨论
• 6.1 当归抽薹植株的生理生化特征
• 6.2 当归叶片中总RNA 的提取
• 6.3 cDNA 的扩增及引物的筛选
• 6.4 变性聚丙烯酞胺凝胶电泳及差异条带的回收
• 6.5 DDRT-PCR 技术在筛选当归早抽薹相关基因的可行性
• Ⅶ 结论
• Ⅷ 参考文献
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介