人尿激酶原突变体的构建与特性分析

论文题目: 人尿激酶原突变体的构建与特性分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 于永生

导师: 李青旺,邓继先

关键词: 人尿激酶原突变体,定点突变,凝血酶和,或纤溶酶原激活剂抑制剂,乳腺特异表达载体,腺病毒载体

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 动脉发生栓塞是血栓类疾病(如心肌梗塞)的一个重要原因。溶栓治疗被认为是治疗血栓最为有效的方法,临床上所用的溶栓药物大多为纤维蛋白溶解酶原(简称纤溶酶原)激活剂类药物,它们可以将纤溶酶原转化为纤溶酶,纤溶酶可以溶解栓塞位置的纤维蛋白,从而恢复血液的畅通。目前常用的溶栓药物有链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)、重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC) 和重组链激酶(r-SK)等,它们的溶栓疗效肯定,但是还存在一些缺陷(如初始再灌注延迟或失败、出血、再梗塞等),阻碍了溶栓疗效的进一步提高。因此,随着对溶栓药物结构和功能的研究,寻找和研制溶栓效率高、特异性强、具有纤维蛋白选择性、半衰期长的溶栓治疗药物对于更有效治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。尿激酶原(pro-UK)是单链的u-PA,属于丝氨酸蛋白酶,能够激活纤溶酶原,使之成为纤溶酶,从而溶解血栓。体内和体外的实验均证明当用量控制在一定范围时,pro-UK 可以使纤维蛋白特异性溶解,但用量加大时,pro-UK 就转化为尿激酶(UK),失去了对纤维蛋白的特异性。对pro-UK 的研究表明,它由411 个氨基酸残基组成;经激肽释放酶或纤溶酶激活可在Lys158-Ile159 断开形成UK;凝血酶可催化pro-UK 的Arg156-Phe157 之间肽键的水解,产生凝血酶断裂型的UK 双链,该双链仅具有微弱的激活纤溶酶原的活性;为了防止系统性纤溶,pro-UK 受到纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)的调控;PAI-1 可通过与pro-UK 共价结合形成复合物而使之失活,是pro-UK主要的抑制剂;一项研究显示pro-UK 表面可变环中的许多带正电荷氨基酸残基(R178RHRGGS184)可与PAI-1 分子中的带负电荷氨基酸残基形成“盐桥”,该盐桥在pro-UK 与PAI-1 结合过程中起决定性作用;用苯甲酰甲醛处理pro-UK,改变四个Arg 残基可使衍生物在血浆中最稳定,且具有更高的溶栓活性,推测该四个Arg残基中有3 个位于pro-UK 表面的可变环(R178RHRGGS184)中。基于以上结果,本研究设计带有突变位点的引物,以天然pro-UK cDNA为模板,采用PCR 介导的定点突变技术对pro-UK 基因进行了突变,构建了三种人pro-UK 的突变体,分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg156 突变成His156 ,构建成pro-UKM1;将PAI-1 的作用位点Arg178、Arg179、Arg181 突变为Lys178、Lys179、His181构建成pro-UKM3;同时将凝血酶和PAI-1 的作用位点突变构建成pro-UKM13。由于蛋白翻译后修饰(糖基化、形成二硫键、亚基组装等)对产物的性质至关重

论文目录:

第一部分 文献综述

第一章 溶栓药物的研究进展

1.1 重组t-PA 的突变体

1.1.1 Reteplase (R-PA)

1.1.2 Tenecteplase(TNK-t-PA)

1.1.3 Lanoteplase (nPA)

1.1.4 Monteplase (E-6010)

1.2 重组scu-PA 的突变体

1.2.1 提高血纤维蛋白专一性和血栓选择性

1.2.2 延长在体内的半衰期

1.3 t-PA和scu-PA的嵌合体

1.4 重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂

1.5 TSV-PA

1.6 链激酶

1.7 葡萄糖球菌激酶

1.8 纳豆激酶

1.9 导向溶栓药物

1.10 溶栓辅助药

1.10.1 血小板膜受体糖蛋白Ⅱb/ Ⅲa 阻断剂

1.10.2 水蛭素(hirudin)

1.10.3 双功能溶栓药物

1.10.4 溶纤酶(fibrolase)

1.11 中草药

1.12 结语

第二章 外源基因在哺乳动物细胞高效表达的研究进展

2.1 哺乳动物高效表达载体的构建

2.1.1 克服位置效应,提高外源基因的表达

2.1.2 提高转录效率,促进外源基因的表达

2.1.3 对翻译水平进行调控,提高目的基因的表达

2.1.4 对整合位点进行优化,提高表达水平

2.1.5 通过增加目的基因的拷贝数,提高目的基因的表达

2.2 对宿主细胞的改造

2.2.1 将某些因子导入宿主细胞,维系细胞的正常生命活动

2.2.2 改造宿主细胞,降低其代谢产物量

2.2.3 改造宿主细胞,使其具有抗凋亡能力

2.2.4 改造CHO细胞,控制其增殖速率

2.2.5 利用IRES将多种蛋白耦联表达

2.3 外源基因的导入方法

2.3.1 磷酸钙沉淀法

2.3.2 电穿孔法

2.3.3 阳离子脂质体转染方法

2.3.4 病毒介导的基因导入方法

2.4 小结

第二部分 试验部分

第三章 人尿激酶原突变体的构建

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 人pro-UK全长cDNA的扩增与序列测定

3.1.3 人pro-UK 突变cDNA的获得与序列测定

3.1.4 尿激酶原突变体表达载体的构建

3.2 结果与分析

3.2.1 人pro-UK全长cDNA的扩增与序列分析

3.2.2 pro-UK基因的突变体的构建

3.2.3 重组表达载体的构建

3.2.4 连入组合突变体13重组表达载体的构建

3.3 讨论

3.3.1 关于尿激酶原的简介

3.3.2 选择突变位点的依据

3.3.3 基因定点突变的方法

3.4 小结

第四章 人尿激酶原突变体在CHO细胞中的表达及特性分析

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 表达载体线性化

4.1.3 细胞培养与传代

4.1.4 CHO细胞对Geneticin的抗性实验

4.1.5 阳离子脂质体法转染CHO细胞

4.1.6 琼脂糖-纤维蛋白溶圈法测定尿激酶原的活性

4.1.7 抗原-抗体中和实验

4.1.8 SDS-PAGE 纤维蛋白自显影分析

4.1.9 Western blot分析

4.1.10 对凝血酶的抵抗力实验

4.1.11 对血浆PAI-1 的抗性实验

4.1.12 同时对血浆PAI-1 和凝血酶的抵抗力实验

4.1.13 建立表达尿激酶原突变体的生物工程细胞系

4.2 结果与分析

4.2.1 转染前表达载体线性化

4.2.2 CHO细胞对Geneticin的抗性实验

4.2.3 转染CHO细胞及抗性克隆的获得

4.2.4 琼脂糖-纤维蛋白溶圈法测定各表达产物的活性

4.2.5 抗原-抗体中和实验

4.2.6 SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析

4.2.7 Westernblot分析

4.2.8 突变体对凝血酶或/和PAI-1的抵抗力分析

4.2.9 建立表达尿激酶原突变体的生物工程细胞系

4.3 讨论

4.3.1 关于表达载体的线性化

4.3.2 关于外源基因导入方法

4.3.3 pro-UK突变体的初步评价

4.3.4 pro-UK突变体在CHO-dhfr~-细胞中的表达

4.4 小结

第五章 指导尿激酶原突变体在动物乳腺特异性表达的重组载体的构建

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 重组PBCI的构建

5.1.3 乳腺特异性表达的重组慢病毒载体的构建

5.2 结果与分析

5.2.1 重组PBCI的构建

5.2.2 乳腺特异性表达的重组慢病毒载体的构建

5.3 讨论

5.3.1 关于乳腺特异性表达载体PBCI

5.3.2 关于乳腺特异性表达

5.3.3 关于慢病毒介导的转基因技术

5.4 小结

第六章 用大肠杆菌同源重组生产重组腺病毒

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 制备超级感受态BJ5183

6.1.3 重组穿梭载体的构建

6.1.4 制备电击感受态BJ5183

6.1.5 重组腺病毒载体的构建

6.1.6 重组腺病毒的生产

6.2 结果与分析

6.2.1 重组穿梭载体的构建

6.2.2 重组腺病毒载体的构建

6.2.3 重组腺病毒的生产

6.3 讨论

6.3.1 腺病毒的生活周期

6.3.2 腺病毒载体的优点

6.3.3 生产腺病毒的几个环节

6.4 小结

第七章 结论

参考文献

致谢

个人简介

发布时间: 2005-12-22

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