番茄抗坏血酸生物合成与代谢途径中相关酶基因的克隆与调控

论文题目: 番茄抗坏血酸生物合成与代谢途径中相关酶基因的克隆与调控

论文类型: 博士论文

论文专业: 蔬菜学

作者: 邹礼平

导师: 叶志彪

关键词: 番茄,抗坏血酸,生物合成与代谢,基因克隆,基因定位,基因表达,遗传转化,基因调控

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 抗坏血酸即维生素C，在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。抗坏血酸是保证人类健康所必需的营养物质，人类自身已经丧失了合成能力，必须从食物中摄取，而植物为人类提供了主要的抗坏血酸来源。抗坏血酸还与植物细胞的分裂、伸长和植株生长有关。抗坏血酸及其代谢相关酶类在清除活性氧方面的作用使得抗坏血酸在植物抵抗环境胁迫中也起着重要作用。通过调控植物抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的表达，可以提高抗坏血酸的含量，改变某些代谢酶类的活性，从而增加植物产品的营养价值，增强植物对逆境的抗性。番茄是一种世界上广为栽培的高营养、高价值的蔬菜作物，然而，目前番茄抗坏血酸生物合成与代谢途径中大部分基因都没有克隆到，对其进行转基因调控的报道几乎没有。因此，本研究以番茄这一重要的蔬菜作物为材料，鉴定和克隆抗坏血酸生物合成和代谢相关酶基因，通过基因工程调控番茄抗坏血酸的代谢，分析转基因番茄的植株生长、生理生化及抗氧化逆境的特性等，以期获得具有应用价值的抗坏血酸含量增加的番茄材料。本研究获得的主要结果如下： 1．克隆了番茄抗坏血酸生物合成途径中上游的GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因的全长cDNA，其GenBank登录号为AY605668，测序结果表明该cDNA全长1535bp，包含一个长为1086bp的完整开放读码框，编码361个氨基酸，氨基酸序列比对结果显示番茄GMP与其他植物GMP的同源性较高。根据GenBank中已公布的番茄抗坏血酸生物合成途径中最后一步合成酶L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶(GLDH)的全长cDNA序列，克隆了番茄GLDH基因，该基因编码区长1767bp，编码588个氨基酸。根据已报道的序列克隆了番茄抗坏血酸代谢途径中促进抗坏血酸再生的单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR1)基因的全长cDNA，该基因编码433个氨基酸。利用RACE技术克隆了2个促进抗坏血酸再生的另一关键酶脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因的全长cDNA，其GenBank登录号分别为AY971873和AY971874，DHAR1的cDNA全长991bp，编码210个氨基酸，DHAR2的cDNA全长1024bp，编码268个氨基酸，分析表明DHAR1属于胞质类型，而DHAR2属于质体类型。利用RACE技术克隆了一个新的番茄胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因，其GenBank登录号为AY974805，该基因的cDNA全长1169

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

缩略词表

1 前言

1.1 课题的提出

1.2 抗坏血酸在植物体内的生理功能

1.2.1 抗坏血酸在植物抗氧化系统中的作用

1.2.2 抗坏血酸在光合作用和光保护中的作用

1.2.3 抗坏血酸在细胞壁代谢和细胞膨大中的作用

1.2.4 抗坏血酸在植物细胞分裂中的作用

1.3 抗坏血酸的生物合成

1.3.1 Smirnoff-Wheeler途径(甘露糖／L-半乳糖途径)

1.3.2 半乳糖醛酸途径

1.3.3 古洛糖途径

1.3.4 肌醇途径

1.4 抗坏血酸的代谢

1.5 抗坏血酸的转运

1.6 抗坏血酸生物合成与代谢相关酶及其基因调控研究进展

1.6.1 磷酸甘露糖异构酶

1.6.2 磷酸甘露糖变位酶

1.6.3 GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶

1.6.4 GDP-D-甘露糖3',5'-差向异构酶

1.6.5 L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶

1.6.6 L-半乳糖脱氢酶

1.6.7 L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶

1.6.8 抗坏血酸过氧化物酶

1.6.9 抗坏血酸氧化酶

1.6.10 单脱氢抗坏血酸还原酶

1.6.11 脱氢抗坏血酸还原酶

1.6.12 其他调控研究

1.7 抗坏血酸与环境胁迫

1.7.1 活性氧及活性氧清除系统

1.7.2 抗坏血酸在环境胁迫条件下的作用

1.8 基于生物信息学的电子克隆方法在植物基因克隆中的应用

1.8.1 基于EST数据库的基因克隆

1.8.2 基于基因组序列数据库的基因克隆

1.9 基因定位研究

1.9.1 基因定位常用的分子标记

1.9.1.1 RFLP

1.9.1.2 RAPD

1.9.1.3 微卫星DNA

1.9.1.4 AFLP

1.9.2 基因定位常用的群体

1.9.3 本研究所用的定位群体

1.10 本研究的目的和内容

2 材料与方法

2.1 植物材料

2.2 菌株、质粒及试剂

2.3 引物设计

2.3.1 基因克隆特异引物

2.3.2 RACE引物

2.3.3 基因定位引物

2.3.4 其他引物

2.4 RT-PCR

2.5 RACE扩增

2.6 基因克隆、测序及分析

2.7 基因定位分析

2.8 基因组织特异性表达分析

2.9 基因数字表达分析

2.10 植物表达载体构建

2.10.1 正义(超量)表达载体构建

2.10.2 RNAi抑制表达载体构建

2.11 番茄的遗传转化

2.12 转基因番茄植株的分子检测

2.12.1 番茄转化再生植株的PCR检测

2.12.2 转基因番茄植株的Southern杂交分析

2.12.3 转基因番茄植株的Northern杂交分析

2.13 转基因番茄植株抗坏血酸含量及酶活性分析

2.13.1 转基因植株抗坏血酸含量测定

2.13.2 转基因植株酶活性测定

2.13.2.1 GLDH活性测定

2.13.2.2 其他酶活性测定

2.14 转基因番茄植株抗氧化逆境初步分析

2.14.1 种子发芽耐盐性试验

2.14.2 叶片失水试验

2.14.3 叶片百草枯处理试验

3 结果与分析

3.1 番茄抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的克隆与分析

3.1.1 番茄GMP全长cDNA的克隆与分析

3.1.2 番茄GLDH基因的克隆与分析

3.1.3 番茄MDHAR1基因的克隆与分析

3.1.4 番茄DHAR基因的克隆与分析

3.1.5 番茄APX基因的克隆与分析

3.1.6 番茄AO基因的克隆与分析

3.2 番茄抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的定位分析

3.2.1 亲本多态性检测

3.2.2 RFLP分析

3.2.3 基因定位结果

3.3 番茄抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的表达分析

3.3.1 番茄GMP基因在不同组织的表达分析

3.3.2 番茄cAPX2基因在不同组织的表达分析

3.3.3 番茄抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的数字表达分析

3.4 植物遗传转化载体的构建

3.4.1 正义(超量)表达载体的构建

3.4.2 RNAi抑制表达载体的构建

3.5 转基因植株的获得

3.6 转基因番茄植株的分子检测

3.6.1 转基因植株的PCR检测

3.6.2 转基因植株的Southern杂交分析

3.6.3 转基因植株的Northern杂交分析

3.7 转基因番茄植株靶基因酶活性及抗坏血酸含量分析

3.7.1 GLDH转基因植株后代酶活性与抗坏血酸含量分析

3.7.2 DHAR1转基因植株后代酶活性与抗坏血酸含量分析

3.7.3 MDHAR1转基因植株酶活性与抗坏血酸含量分析

3.8 转基因番茄植株抗逆性的初步观察

3.8.1 转基因植株的离体叶片失水率

3.8.2 转基因植株耐盐性初步观察

3.8.3 转基因植株叶盘百草枯处理后的表现

4 讨论

4.1 生物信息学在番茄基因克隆中的应用

4.2 抗坏血酸代谢相关酶的多基因家族现象

4.3 IL系在番茄遗传育种研究中的作用

4.4 数字表达分析在基因表达分析中的可靠性

4.5 转基因调控抗坏血酸代谢的效果

4.6 通过调控抗坏血酸代谢提高植物抗逆性的可行性

参考文献

致谢

附录

附录一：植物DNA的小量法提取程序

附录二：TRIZOL一步法提取植物总RNA方法

附录三：质粒的小量提取方法

附录四：SOUTHERN BLOTTING程序

附录五：NORTHERN BLOTTING程序

附录六：登记基因信息

附录七：载体质粒图

附录八：博士在读期间已发表或接受的论文及会议论文摘要

发布时间: 2006-12-25

参考文献

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