论文摘要
目的:JBP485（cyclo-trans-4-L-Hydroxyprolyl-L-serine,环状-反式-4-左旋-羟脯氨酰-左旋-丝氨酸）是首次从抗肝炎药物蓝内克（Laennec）注射剂中分离出的一种二肽。目前,已经用化学方法将JBP485人工合成。根据文献报道,JBP485经胃肠道吸收后对ANIT（α-naphthylisothiocyanate）和CCL4（carbon tetrachloride）致毒的大鼠具有抗炎和肝保护作用。本课题旨在进一步研究JBP485对Con A诱导的小鼠自身免疫性肝损伤所产生的肝保护作用,并对其可能的保护机制进行初步探讨。方法:采用尾静脉注射法将刀豆球蛋白A（concanavalin A,Con A）注射入小鼠体内,建立小鼠自身免疫性肝损伤模型。将雌性BALB/c小鼠随机分为三组,即正常对照组、模型组、JBP485治疗组。模型组和治疗组分别将Con A（10mg/kg,1.5mg/ml）经尾静脉一次性注射;正常对照组用生理盐水代替Con A注射。注射Con A前0.5小时、注射后2小时、5小时,治疗组小鼠分别用不同剂量的JBP485（ 3.125mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg;浓度分别为0.3125mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml）灌胃给药,对应的模型组和正常对照组小鼠分别用等体积的生理盐水代替治疗药物JBP485灌胃。注射Con A后8小时,将各实验组小鼠用摘除眼球法取血,37℃静置30分钟后3000转/分钟离心10分钟,分离血清,测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ Alanine Aminotransferase,ALT）和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）的活力。经过统计学分析得出,JBP485对Con A性小鼠肝损伤具有肝保护作用,且其最佳治疗剂量为25mg/kg。按上述实验方法和给药时间,将JBP485的治疗剂量确定为25mg/kg,在注射Con A后8小时,将水合氯醛麻醉后的小鼠用颈椎脱臼法处死,立即取出肝脏,用预冷的生理盐水将肝脏冲洗三遍,将肝脏表面的血液冲掉。然后将实验各组小鼠同一部位的肝组织（肝右叶）浸泡在4%福尔马林溶液中固定,经石蜡包埋、切片,HE染色后光镜下观察肝脏的组织形态学变化;用免疫组织化学方法检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）在肝脏组织中的表达。将其他部分肝组织加入组织匀浆液匀浆,测定肝组织中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（maleic dialdehyde, MDA）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）和一氧化氮（nitric oxide, NO）的含量。小鼠在Con A注射后8小时,用小鼠肝灌流的方法分离各组小鼠的肝细胞。提取各组小鼠肝细胞中的DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA损伤断裂后的DNA Ladder;分别提取各组小鼠肝细胞中的总RNA,用RT-PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction）法检测凋亡相关基因bcl-2和bax在肝脏组织中的表达。结果:1.与正常对照组相比,模型组:（1）光镜下组织形态学观察,可见肝组织失去原有正常组织形态而呈明显的病理损伤,表现肝细胞肿胀、胞浆着色变浅、肝细胞呈水肿状、胞核增大、肝窦扩张且有明显的瘀血、窦索结构紊乱,伴大量炎症细胞浸润,可见片状坏死灶。（2）血清酶学检测:ALT和LDH均显著升高（p<0.01）,提示肝脏严重受损。（3）肝组织MDA、MPO、NO水平显著升高（p<0.01）,而SOD水平明显降低（p<0.01）,表明Con A性肝损伤能够致使肝细胞发生脂质过氧化,氧自由基清除能力下降,白细胞浸润增多,而且伴有NO性损伤。（4）免疫组织化学检测肝组织TNF-α和ICAM-1表达均显著增强。（5） DNA Ladder检测可见模型组DNA呈明显的阶梯状,说明Con A性肝损伤还涉及到DNA的断裂损伤。（6） RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2/bax比值降低（p<0.05）,提示模型组肝损伤还与细胞凋亡有关。2.与模型组相比,JBP485治疗组:（1）组织形态学上观察,肝脏的受损程度明显减弱,表现为坏死面积缩小或不明显,肝细胞膨胀减轻,胞核变小,肝小叶边界明显,肝索清晰,炎性细胞浸润大大减少。（2）肝细胞受损程度明显减轻,表现为血清ALT及LDH水平显著降低（p<0.01和p<0.05）,且JBP485的治疗效果具有剂量依赖性。（3）肝细胞脂质过氧化损伤及白细胞浸润减轻,自由基清除能力增强,表现为肝脏MDA及MPO含量减少（p<0.01, p<0.01）及SOD活力恢复（p<0.01）;NO的生成量也减少（p<0.05）。（4）肝组织中TNF-α和ICAM-1表达减弱。（5） DNA Ladder显示肝细胞的DNA断裂损伤程度也明显减弱。（6）凋亡相关基因bcl-2/bax比值升高（p<0.05）。结论:JBP485对Con A引起的自身免疫性肝损伤有肝保护作用,其作用机制为:1.增强肝组织自由基清除能力、抑制肝细胞脂质过氧化损伤;2.减弱因NO过度表达而引起的细胞毒作用;3.减少炎性细胞在炎症和组织损伤区域的聚集;4.抑制炎性细胞因子的释放;5.抑制肝细胞凋亡。