半枝莲化学成分和抗肿瘤活性的初步研究

论文摘要

目的半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲（Scutellaria barbata）的干燥全草,是中医处方和成药中的常用中药材,临床上常与其他中草药配伍治疗原发性肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、妇科肿瘤。半枝莲全草含黄酮类、二萜、生物碱、甾体、多糖、挥发油、有机酸等化学成分,能否得到合理有效利用,关键在于对其化学成分的药理活性及作用机理研究。近年来,国内外学者对半枝莲抗肿瘤活性的研究结果表明半枝莲粗提取物体外对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用,但其粗提取物中所含化学成分与抗肿瘤活性的关系尚不明确,缺乏对半枝莲生物活性物质基础及作用机制的研究。此外,大量研究表明植物中所含的某些生物碱类化合物具有明显的抗肿瘤活性。因此,本课题对半枝莲生物碱提取物（Alkaloid Extract of Scutellaria barbata, AESB）的体外抗肿瘤活性进行研究,旨在阐明AESB对人肝癌HepG-2细胞和人鼻咽癌CNE-1细胞的体外增殖抑制作用及其可能作用机制;并对AESB所含化学成分进行分离,以期得到具有抗肿瘤活性的单体化合物,从而为更好地开发和利用中草药半枝莲提供理论依据。方法1.AESB溶液的制备半枝莲干燥地上部分,粉碎,过筛,酸性乙醇（12 mol/L HCl-95% EtOH,2：100,V/V）浸泡72 h,超声波提取3次,每次45 min,提取液减压抽滤后于旋转蒸发仪上减压浓缩至浸膏状,将浸膏用2%稀盐酸溶液混悬,静置过夜,减压抽滤后合并滤液于分液漏斗中氨水调PH=I0,氯仿萃取至萃取液无生物碱反应为止,合并氯仿萃取液,减压浓缩即得半枝莲粗生物碱浸膏；将半枝莲粗生物碱浸膏再次用2%稀盐酸溶液溶解,氨水调PH=10,氯仿萃取至萃取液无生物碱反应为止,合并氯仿萃取液减压浓缩即得AESB。电子天平称取0.30 g AESB,2%稀盐酸溶液溶解,稀NaOH溶液调PH=7.4,生理盐水稀释至10 mL,于超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌即得30 mg/mL原药液,备用。实验前用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基分别稀释至终浓度为0.75、1.0、1.5和2.0 mg/mL。2.细胞培养人肝癌HepG-2细胞和人鼻咽癌CNE-1细胞均用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基（内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素）,置于37℃,5%CO2培养箱中常规培养,隔天换液,待培养瓶中细胞生长至约80%融和时,进行传代培养。3.MTT法测定HepG-2和CNE-1细胞的生长抑制率取对数生长期的HepG-2和CNE-1细胞,胰酶消化后混悬于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,细胞计数板计数调整细胞密度为1×105个/mL,接种于96孔板中,每孔100μL,置37℃,5%C02的培养箱中培养。待24 h细胞完全贴壁后,吸弃96孔板内原培养基,PBS洗涤2遍,每孔加90μL新鲜培养基,试验组加入10μL不同浓度的AESB溶液（终质量浓度分别为0.75、1.0、1.5和2.0 mg/mL）,阳性组加入10μL生理盐水稀释的5-FU溶液（终质量浓度为250μg/mL）,阴性组加入等体积生理盐水,每个组设3个平行复孔,分别培养24、48、72和96h；到各时间点后取出,吸弃原培养基,每孔加入90μL新鲜培养基,然后加入10μL MTT溶液,继续培养4h,小心吸弃96孔板内上清液,每孔加入150μL DMSO溶液,轻微震荡10 min使结晶充分溶解后于酶标仪570nm波长处测定各孔OD值,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（阴性组OD值-试验组OD值）/阴性组OD值×100%。4. Annexin V-FITC/PI双染检测HepG-2和CNE-1细胞早期凋亡率取对数生长期的HepG-2和CNE-1细胞,胰酶消化后混悬于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,细胞计数板计数调整细胞密度为2×105个/mL,接种于6孔板中,每孔2 mL,置37℃,5%CO2的培养箱中培养。待24 h细胞完全贴壁后,吸弃6孔板内原培养基,PBS洗涤2遍,每孔加180μL新鲜培养基,试验组加入20μLAESB溶液（终质量浓度为0.75 mg/mL）,阳性组加入20μL生理盐水稀释的5-FU溶液（终质量浓度为250μg/mL）,阴性组加入等体积生理盐水；细胞继续培养48小时后,吸出原培养基置于离心管中,胰酶（不含EDTA）消化贴壁细胞成单细胞悬液,倒入离心管,PBS洗涤6孔板2次,1000 rpm离心5 min,弃上清,PBS洗涤2次,细胞按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒操作步骤处理后,于流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。5.流式细胞仪检测HepG-2和CNE-1细胞周期分布取对数生长期的HepG-2和CNE-1细胞,胰酶消化后混悬于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,细胞计数板计数调整细胞密度为2×105个/mL,接种于6孔板中,每孔2 mL,置37℃,5%CO2的培养箱中培养。待24 h细胞完全贴壁后,吸弃6孔板内原培养基,PBS洗2遍,每孔加180μL新鲜培养基,试验组加入20μLAESB溶液（终质量浓度为0.75 mg/mL）,阳性组加入20μL生理盐水稀释的5-FU溶液（终质量浓度为250μg/mL）,阴性组加入等体积生理盐水；细胞继续培养48h后,吸出原培养基置于离心管中,胰酶（不含EDTA）消化贴壁细胞成单细胞悬液,倒入离心管,PBS洗涤6孔板2次,1000 rpm离心5 min,弃上清,PBS洗涤2次,细胞用-20℃的70%乙醇固定过夜,1000 rpm离心5 min,弃乙醇,PBS洗涤2次,1000rpm离心5 min,弃PBS；500μLPBS重悬细胞,加入50μL RNase和450μL PI染液（50μg/mL）避光染色15 min,转至流式检测管,流式细胞仪检测细胞周期分布,ModiFit LT2.0软件进行数据分析。6.AESB中单体化合物的分离采用硅胶柱色谱、硅胶薄层色谱和重结晶等手段对AESB中的化学成分进行分离,综合运用红外光谱（IR）、质谱（MS）、一维核磁共振光谱（1H-NMR、13C-NMR、DEPT、NOESY-1D、NOE差谱）、二维核磁共振光谱（1H-1 COSY、HSQC、HMBC）及X-ray单晶衍射等现代波谱学技术对分离所得单体化合物进行结构解析和鉴定。7.统计学处理实验数据用均数±标准差（x±s）表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,Excel软件作图。不同浓度AESB处理HepG-2和CNE-1细胞不同时间后的细胞生长抑制率采用析因设计方差分析,多重比较采用Dunnett T3; 0.75 mg/mLAESB处理HepG-2和CNE-1细胞48 h后的早期凋亡率和细胞周期分布比例采用One-Way ANOVA进行分析,方差齐同,采用LSD法进行组间两两比较,方差不齐,采用Dunnett T3法进行组间两两比较。显著性水准a=0.05,P<0.05为有统计学差异。结果1.AESB对HepG-2和CNE-1细胞体外增殖的影响不同浓度AESB作用HepG-2和CNE-1细胞不同时间后,不同浓度组AESB对HepG-2和CNE-1细胞的生长抑制率有显著性差异（HepG-2:F=136.216, P=0.000; CNE-1:F=341.470, P=0.000）;不同时间组AESB对HepG-2和CNE-1细胞的生长抑制率有显著性差异（HepG-2:F=118.114, P=0.000; CNE-1:F=308.147,P=0.000）；时间与AESB之间的交互效应也具有统计学差异（HepG-2: F=3.654,P=0.003; CNE-1:F=7.747, P=0.000）。MTT法检测结果表明：AESB对HepG-2和CNE-1细胞体外增殖具有抑制作用,在一定浓度和时间范围内呈剂量-时间依赖性。2.AESB对HepG-2和CNE-1细胞早期凋亡的影响0.75 mg/mL AESB作用HepG-2细胞48 h后,其早期凋亡率（25.12±0.91%）与阴性组（2.97±0.49%）比较有统计学差异（P=0.000）; 0.75 mg/mL AESB作用CNE-1细胞48 h后,其早期凋亡率（5.13±0.70%）与阴性组（1.42±0.26%）比较有统计学差异（P=0.004）。实验结果表明：0.75 mg/mL AESB作用HepG-2和CNE-1细胞48 h后可诱导其细胞早期凋亡。3.AESB对HepG-2和CNE-1细胞周期分布的影响0.75 mg/mL AESB作用HepG-2细胞48 h后,G2/M期细胞所占比例较阴性组有所增加,具有统计学差异（P=0.002）,S期和Go/G1期细胞所占比例较阴性组均没有统计学差异（P>0.05）。0.75 mg/mL AESB作用CNE-1细胞48 h后,Go/G1期和G2/M期细胞所占比例较阴性组有所降低,具有统计学差异（P值分别为0.018和0.008）,S期细胞所占比例较阴性组有所增加,具有统计学差异（P=0.001）。实验结果表明：0.75 mg/mL AESB作用HepG-2和CNE-1细胞48 h后能阻滞HepG-2细胞周期于G2/M期,CNE-1细胞周期于S期。4.AESB中单体化合物的分离从AESB中分离纯化得到3个单体化合物,分别鉴定为p-谷甾醇,单萜内酯,丁香酸乙酯。结论1.AESB能抑制人肝癌HepG-2细胞和人鼻咽癌CNE-1细胞体外增殖,诱导其细胞早期凋亡,阻滞HepG-2细胞周期于G2/M期,CNE-1细胞周期于S期。2.从AESB中分离得到3个单体化合物：β-谷甾醇（1）,单萜内酯（2）,丁香酸乙酯（3）；其中,化合物2和3均为首次从该属植物中分离得到。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 半枝莲抗肿瘤活性的初步研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 半枝莲化学成分的初步研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间发表论文
• 致谢
• 统计学审稿证明