论文摘要
TGF-β超家族由大量结构相关的多肽生长因子组成,包括TGF-β、激活素和骨形态发生蛋白（BMP）3大类,TGF-β作为TGF-β超家族成员之一,是一种多功能的生长因子,由于其作用细胞的类型、分化程度、外环境及是否有其他生长因子作用的不同,因而它的活性具有多样性。因为它的多功能,使它在胚胎发生发展、肿瘤的形成、免疫反应、炎症反应、创伤愈合中具有重要作用。随着TGF-β的下游分子Smads蛋白研究的深入,TGF-β超家族的作用也越来越受到重视,在人类组织细胞中仅存在TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等三种,其中研究较多的是TGF-β1。资料表明Smads在心脏发育、细胞增殖、细胞生长和凋亡中起重要作用,基于Smads的不同亚型以及在特定情形下Smads与其它转录因子之间的相互作用和不同激酶对Smads的活性调节,Smads激活后具有不同作用。已有研究表明骨形态发生蛋白（BMP）通过Smad1的信号转导机制能够减轻心肌细胞缺血再灌注损伤。但TGF-β1及其下游信号分子Smad3在心肌细胞缺血再灌注损伤及缺血预适应中的信号转导研究较少。缺血再灌注损伤机制及心肌保护的研究是当今倍受重视的课题。为了干预心肌缺血梗死及保护心肌,文献报道研究了许多药物如β-受体阻滞剂、自由基清除剂、钙拮抗剂等的心肌保护作用,其中对缺血预适应（ischemic preconditioning,IPC）保护心肌的研究一直是一个热点。缺血预适应的心肌保护作用表现为缩小梗死面积、促进心肌功能恢复、保护心肌超微结构,减少再灌注后心律失常等,但缺血预适应心肌保护作用的机理迄今仍未完全明了。目前对心肌细胞缺血预适应减轻心肌缺血再灌注损伤作用的机制主要集中在线粒体ATP敏感性钾离子通道、蛋白激酶C、NF-κB等分子信号转导机制。既然TGF-β1/Smad3可能与心肌细胞凋亡有关,而缺血预适应已经被证明能够减少心肌细胞凋亡率,我们推测缺血预适应的机制可能与TGF-β/Smad3信号转导通路有关。本实验以体外培养乳鼠心肌细胞为实验研究和观察对象,建立缺血再灌注损伤的细胞模型,并以TGF-β1及其阻断剂进行干预。采用细胞TUNEL染色、DAPI荧光染色、LDH漏出量测定及流式细胞仪检测,多角度、多时程检测心肌细胞凋亡比率并通过ELISA方法检测细胞Smad3蛋白表达,从细胞和分子水平探讨TGF-β1/Smad3对缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的作用以及缺血预适应对TGF-β1/Smad3信号转导通路的调控。进一步探讨缺血再灌注损伤中心肌保护机制,为临床围手术期的心肌保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。本实验主要分为两个部分:一、乳鼠心肌细胞的分离培养及缺血再灌注损伤和缺血预适应模型的制备（一）乳鼠心肌细胞分离培养及缺血再灌注和缺血预适应模型的建立1、乳鼠心肌细胞分离培养、鉴定及活力测定按改良的Simpson等的方法进行消化分离,采用差速贴壁分离纯化方法培养心肌细胞,培养4天后,细胞呈同步搏动。利用α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化鉴定,心肌细胞的纯度超过90%,台盼蓝染色计算细胞活力超过94%。2、缺血再灌注和缺血预适应模型的建立细胞培养成功后,对心肌细胞以缺氧缺糖模拟缺血,恢复氧和糖的供应模拟再灌注,利用细胞培养液的变化（缺氧、缺糖、乳酸堆积、酸中毒,再灌注后恢复正常）模拟缺血再灌注损伤,同时给予TGF-β1（5ng/ml）进行干预。利用短暂的缺氧、复氧培养模拟缺血预适应。3、缺血再灌注和缺血预适应模型有效性验证有效性验证主要研究缺血再灌注和缺血预适应模型心肌细胞凋亡率,实验分为3组,正常对照组心肌细胞凋亡率为5.92±1.88%,缺血再灌注组凋亡率为28.99±6.96%,缺血预处理组凋亡率为13.85±1.40%;三者之间存在显著差异（P＜0.01）。说明采用本实验方法建立的缺血再灌注及缺血预适应模型是有效可行的。二、TGF-β1在缺血再灌注损伤和缺血预适应信号转导中的作用及机制实验分组:培养4天的乳鼠心肌细胞随机分为6组1、正常对照组（A组）:含10%胎牛血清DMEM培养基（37℃,5%CO2、95%空气培养箱）培养48小时,更换培养基后同样条件下继续培养3小时:2、缺血再灌注诱导凋亡模型组（B组）:不含血清的低糖DMEM培养基,厌氧培养箱（N295%,CO25%）中培养48小时后,10%胎牛血清DMEM培养基,37℃、5%CO2、95%空气培养箱中培养3小时;3、TGF-β1干预组（C组）:不含血清的低糖DMEM培养基加入TGF-β1（5ng/ml）,厌氧培养箱（N295%,CO25%）中培养48小时后,10%胎牛血清、TGF-β1.（5ng/ml）DMEM培养基,37℃、5%CO2、95%空气培养箱中培养3小时;4、TGF-β1受体抑制剂干预组（D组）:培养基中加入LY364947（59nmol/L）,余同B组;5、缺血预适应组（E组）:不含血清的低糖DMEM培养基,厌氧培养箱（N295%,CO25%）中培养6小时后,10%胎牛血清DMEM培养基,37℃、5%CO2、95%空气培养箱中培养3小时;再模拟进行缺血再灌注,同B组;6、TGF-β1+缺血预适应组（F组）:不含血清的低糖DMEM培养基加入TGF-β1（5ng/ml）,厌氧培养箱（N295%,CO25%）中培养6小时后,10%胎牛血清、TGF-β1（5ng/ml）DMEM培养基,37℃、5%CO2、95%空气培养箱中培养3小时;再模拟进行缺血再灌注,同C组。（一）针对细胞凋亡不同时程的生化特征应用多种方法检测心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要表现,并在后期的心功能损伤中起主要作用1、TUNEL法原位检测细胞凋亡使用TUNEL试剂盒检测凋亡心肌细胞。结果显示:C组见较多阳性染色细胞（54.60±8.49%）,明显高于其他各组（P＜0.01）,说明TGF-β1加重缺血再灌注损伤后心肌细胞损害;D组心肌细胞凋亡率（20.48±1.94%）低于B组（31.10±4.21%）凋亡率（P＜0.01）,说明TGF-β1受体抑制剂可以有效减少缺血再灌注损伤后心肌凋亡;E组心肌细胞凋亡率（12.21±0.92%）与F组（14.16±1.66%）无明显差异（P＞0.05）,说明缺血预适应可以有效抑制TGF-β1对心肌细胞的损害;A组心肌细胞阳性率（5.24±0.99%）明显较其他各组低（P＜0.01）。2、AnnexinV-FITC/PI双标记检测细胞凋亡以AnnexinV和PI标记心肌细胞,以流式细胞仪进行凋亡及坏死细胞定量检测,灵敏度高。检测结果与TUNEL结果相似:C组检出较多凋亡细胞（54.19±11.86%）,明显高于其他各组（P＜0.01）;D组（21.31±3.78%）心肌细胞凋亡率与B组（30.75±4.88%）有显著差异（P＜0.01）,说明TGF-β1受体抑制剂可以有效减少缺血再灌注损伤后心肌凋亡;E组心肌细胞凋亡率（12.45±1.52%）与F组（14.10±1.78%）明显低于B组心肌细胞凋亡率（P＜0.01）,但二者之间无明显差异（P＞0.05）,说明缺血预适应可以抑制TGF-β1诱导的缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡,A组心肌细胞阳性率（5.50±1.38%）明显低于其他各组（P＜0.01）。3、乳酸脱氢酶漏出量测定留取各组细胞处理后培养上清,4℃保存待测。HITACH全自动生化分析仪检测。乳酸脱氢酶漏出量可以间接反映心肌细胞凋亡情况,结果与以上两种方法检测结果相似:C组中LDH漏出量（121.94±12.98U/L）明显高于其他组（P＜0.01）;D组（39.73±3.23 U/L）低于B组（52.98±4.94 U/L）的LDH漏出量（P＜0.01）;E组（14.80±2.49 U/L）与F组（15.70±1.29%）无明显差异（P＞0.05）;A组LDH漏出量（6.59±1.45 U/L）阳性率明显低（P＜0.01）。（二）心肌细胞缺血再灌注损伤与Smad3表达量的关系收集各组处理后细胞上清液,4℃保存。机械法收集细胞加入已收集的细胞上清液,加入等体积裂解液,超声裂解细胞,ELISA方法进行检测。正常心肌细胞（A组）Smad3表达量为21.77±2.32ng/ml,C组Smad3表达量（47.51±4.60ng/ml）较其他各组明显高（P＜0.01）,说明TGF-β1可以诱导缺血再灌注损伤中Smad3表达增加;D组（25.66±1.51ng/ml）与B组（35.7±2.43ng/ml）相比Smad3表达量明显低,有显著差异（P＜0.01）,但与A组之间无明显差异（P＞0.05）,说明TGF-β1受体抑制剂可以有效抑制Smad3表达;E组（29.47±1.36 ng/ml）与D组、F组（34.12±1.90 ng/ml）无明显差异（P＞0.05）。说明缺血预适应与TGF-β1受体抑制剂作用相似,同样可以减少心肌细胞缺血再灌注损伤中Smad3表达。主要结论:本研究应用体外培养乳鼠心肌细胞,建立缺血再灌注损伤的细胞模型,以TGF-β1进行干预。针对细胞凋亡的各种特征和时程特点,应用多种方法检测心肌细胞凋亡以及缺血再灌注损伤后心肌细胞Smad3表达的变化,以阐明TGF-β1/Smad3对心肌细胞缺血再灌注损伤的作用,并进一步评价IPC对TGF-β1/Smad3信号转导通路的影响,以探讨TGF-β1在缺血预适应心肌保护中的作用。主要结论如下:1、按改良的Simpson等的方法进行消化分离,采用差速贴壁分离纯化方法培养的心肌细胞纯度和活力可达到满意效果。2、TGF-β1可以促进Smad3表达增加,同时加重缺血再灌注损伤后心肌细胞损害,即Smad3可以促进缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡。3、缺血预适应可以抑制TGF-β1/Smad3的信号转导,从而减少缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡。
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