牛蒡子苷元抗炎机理及双氢杨梅素对神经细胞保护机制的实验研究

论文摘要

牛蒡子苷元（Arctigenin）是从菊科两年生草本植物牛蒡属牛蒡Arctium lappaL的干燥成熟果实牛蒡子中分离而来的木脂素类化合物。牛蒡子为我国传统中药,有广泛的生物学效应：抗炎,抗氧化,抗肿瘤,神经细胞保护作用。另外,Arctigenin能够抑制HIV病毒的复制。在我国,Arctigenin用于治疗炎症有悠久的历史。以前的研究发现,Arctigenin能够抑制LPS诱导的NF-κB的活性。到目前为止,有关Arctigenin的报道大都集中在NF-κB通路。在本研究中,我们探讨了Arctigenin抗炎的其他信号机制。JAK-STAT信号通路能够被包括细胞因子和生长因子在内的许多配体激活,从而介导免疫和炎症反应。JAK家族包括四个成员：JAK1, JAK2, JAK3和TYK2,然而在巨噬细胞中主要以JAK2表达为主。细胞被适当的配体刺激后可以诱导受体的寡聚化并且导致局部的JAKs聚集增加,继而引起他们的磷酸化。JAKs的磷酸化可以引起下游的STATs磷酸化。当JAKs被磷酸化后,STATs就转录到核内从而调控相关靶基因如iNOS和COX-2等的表达。细胞因子源的免疫信号在强度和时间上通常受到严密的调控。JAK-STAT信号的抑制性分子（SOCSs）家族是JAK-STAT信号的负调控因子。SOCS家族由SOCS1-7,和CIS（细胞因子诱导的Src同源结构域蛋白）组成。SOCS蛋白通过直接和JAK家族蛋白或者磷酸化的酪氨酸残基相互作用抑制JAK-STAT信号。以前的研究证实Arctigenin具有抗炎作用,但是其抗炎的分子机制仍然不清楚。在本研究中,我们发现Arctigenin有效地抑制了LPS诱导的iNOS （mRNA,蛋白）基因表达及酶活性。抗炎效应部分上归功于Arctigenin对ROS依赖的JAK-STAT信号通路的抑制。与抗氧化剂NAC相似,Arctigenin明显的抑制了STAT1和STAT3的磷酸化,从而阻断了STAT1和STAT3的入核。利用iNOS的荧光素酶基因实验,我们发现LPS刺激后,iNOS的转录活性明显升高。然而Arctigenin预处理剂量依赖地降低iNOS的转录活性。同时,转染STAT1（Y7F）和STAT3（Y7F）组的iNOS的转录活性也被抑制。这些结果说明STAT通路是iNOS转录的重要调控子,从而抑制STAT介导的反应基因iNOS的产生。为了进一步证实Arctigenin的抗炎效应是否由抑制STAT信号所致,我们检测了STAT介导的反应基因IL-1β, IL-6和MCP-1的产生。研究显示,Arctigenin预处理剂量依赖地降低LPS诱导的炎症因子的产生。接下来,我们的研究进一步证实, Arctigenin能够抑制JAK2的磷酸化,而不能抑制JAK1。另外,SOCSs的诱导表达也是Arctigenin抑制JAK-STAT信号的机制之一。Arctigenin预处理能够诱导SOCS3的表达,而SOCS1则不受其影响,这意味着SOCS3有助于Arctigenin抑制JAK-STAT信号通路。这些结果说明Arctigenin能够抑制IL-1β, IL-6和MCP-1的产生,而这些过程则需要JAK2-STAT1/3信号的抑制。Ampelopsin（双氢杨梅素）是存在于藤茶中的一种重要的黄酮类化合物,研究表明Ampelopsin有多种药理效果,如消炎,抗氧化以及保肝等作用。以前的研究发现,Ampelopsin在离体的红细胞,Hela细胞和淋巴细胞中对H2O2引起的氧化损伤有良好的抑制作用,并且证实了Ampelopsin的药理效果与其本身清除自由基,预防脂质过氧化特性相关。这些结果提示我们Ampelopsin有可能在神经退行性疾病的防治上发挥作用。然而,Ampelopsin是否具有神经细胞保护的作用还未见文献报道。在本研究中,我们首次研究了Ampelopsin对过氧化氢引起的PC12细胞氧化损伤的影响。细胞预孵育Ampelopsin1h后,能够降低H2O2所致细胞存活率下降,LDH的渗漏,细胞凋亡率。另外,荧光染色实验结果表明,Ampelopsin剂量依赖地抑制ROS的产生。另一方面,Ampelopsin能够抑制H2O2诱导的线粒体膜电位降低和PARP, Caspase-3蛋白的切割。进一步研究表明,Ampelopsin能够抑制H2O2诱导的p-38信号的激活,而不影响JNK和ERK磷酸化的。说明Ampelopsin能够部分上通过抑制p-38信号来抵抗H2O2所致的PC12细胞凋亡。以上结果提示,Ampelopsin对H2O2所致PC12细胞具有明显的保护作用。接下来,我们进一步研究了Ampelopsin保护PC12细胞的相关机制,我们首次发现不同浓度的Ampelopsin预处NPC12细胞12h,能够剂量依赖性的上调HO-1的表达。在同样的实验条件下,15μg/ml Ampelopsin分别孵育不同时间可以时间依赖性增加HO-1的表达。为了阐明参与Ampelopsin诱导HO-1的信号通路,我们检测了一些上游激酶。Ampelopsin处理后以浓度依赖和时间依赖方式激活Akt和ERK信号通路。为了进一步验证是否Akt和ERK激酶参与HO-1的表达和神经细胞保护作用,我们运用了Akt和ERK激酶的特异性抑制剂。Western blot结果显示,Ampelopsin处理前预先给予抑制剂LY294002或者U0126能够抑制HO-1的上调。同样MTT的结果也显不,Ampelopsin处理前预先给予抑制剂LY294002或者U0126能够阻断Ampelopsin对PC12的保护作用。综上所述,Ampelopsin能够通过激活Akt和ERK信号通路诱导HO-1的表达,从而保护细胞免于H2O2所致的细胞氧化损伤。本研究认为Ampelopsin可能是治疗神经退行性疾病的有前景的化合物。

论文目录

• 主要缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 Arctigenin对LPS诱导iNOS表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 JAK-STAT信号通路在Arctigenin抗炎中的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 2O₂导致PC12细胞损伤的保护作用'>第三部分 Ampelopsin对H₂O₂导致PC12细胞损伤的保护作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 2O₂诱导PC12细胞损伤的信号机制研究'>第四部分 Ampelopsin保护H₂O₂诱导PC12细胞损伤的信号机制研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述1
• 参考文献
• 附录
• 致谢