PtDRG01基因原核表达分析及遗传转化的初步研究

论文摘要

毛白杨（Populus tomentosa Carr.）是我国特有的乡土杨树,具有速生、优质和抗逆性强等特性,在我国北方,尤其是在黄河中下游林业生产和生态环境建设中占有重要地位。但随着栽培面积的不断扩大,一些病害的发生严重影响着它的推广。叶锈病是危害最为严重的病害之一,以马格栅锈菌（Melampsora magnusiana Wanger）致病性为最强。它通常侵害幼苗及成年树的叶片和芽,从而形成黄色小斑点,致使植物光合效率降低,造成受害叶片提早落叶,严重时则会形成大型枯斑,病叶和病芽枯死,严重影响了杨树的生长和发育。而目前有关毛白杨抗病方面的研究还很少,尤其在抗病遗传资源筛选、抗病品种选育和抗病基因定位与克隆等方面还未见报道,因此,在对毛白杨抗病遗传资源研究的基础上,分离抗叶锈病基因并对其产物的功能进行研究显得尤为必要,最终获得抗叶锈病的毛白杨转基因植株,将对毛白杨抗病性状的遗传改良具有重要的理论意义和生产价值。本研究克隆了NBS型抗病相关基因PtDRG01,并对其进行了原核表达分析和毛白杨RNAi基因转化研究,得到了如下主要结论:1.在已分离的NBS型抗病候选基因PtDRG01的基础上,构建了其原核表达载体pGEX-KG-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析显示,PtDRG01表达的蛋白分子量约为79kD。同时对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行了优化与分析。结果表明,最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目的蛋白,然后采用改良钼蓝比色法对PtDRG01蛋白进行生化功能分析。结果显示该蛋白仅能微弱地催化ATP的水解,其生化特性还有待采用同位素标记法等更灵敏的方法进一步研究。2.本研究成功建立了三倍体毛白杨无性系[（P. tomentosa×P. bolleana）×P. tomentosa]高效的叶片再生体系,构建了PtDRG01基因的RNAi表达载体,并采用基因枪法进行三倍体毛白杨高抗无性系的遗传转化研究,获得了一批卡那霉素抗性植株,PCR检测证实外源基因已整合到三倍体毛白杨基因组内,进一步的分子检测与抗病试验正在进行之中。本研究为毛白杨抗病基因的功能鉴定及抗病性状的分子育种提供了重要的科学理论依据,具有重要的应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 杨树溃疡病抗病研究概况
• 1.1.1 发病规律
• 1.1.2 致病机理
• 1.1.3 抗病机制
• 1.1.4 溃疡病抗病育种研究
• 1.2 杨树烂皮病抗病研究概况
• 1.2.1 病原菌研究
• 1.2.2 致病原因
• 1.2.3 烂皮病的防治方法及抗病育种研究
• 1.3 杨树叶锈病抗病研究进展
• 1.3.1 杨树锈病病原菌研究
• 1.3.2 抗锈病基因克隆及分子标记研究
• 1.3.3 抗锈病育种研究
• 1.4 存在的问题与展望
• 1.5 本研究的方法与技术路线
• 2 PtDRG01 基因的原核表达研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 基因与质粒
• 2.1.2 PtDRG01 基因原核表达载体的构建
• 2.1.3 筛选PtDRG01 基因诱导表达最佳条件
• 2.1.4 表达蛋白性质分析
• 2.1.5 SDS-PAGE 电泳检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PtDRG01 基因原核表达载体构建及重组子鉴定
• 2.2.2 PtDRG01 基因表达蛋白最佳诱导条件的筛选
• 2.2.3 融合蛋白表达特性分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 原核表达载体pGEX-KG 的选择
• 2.3.2 PtDRG01 基因的原核表达条件优化
• 2.4 小结
• 3 PtDRG01 蛋白的生化功能分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 PtDRG01 蛋白的提取
• 3.1.2 PtDRG01 蛋白的纯化
• 3.1.3 PtDRG01 蛋白的生化特性分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 菌体破碎、蛋白提取及浓度测定
• 3.2.2 表达蛋白的纯化及鉴定
• 3.2.3 表达蛋白的特性分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 菌体破碎及浓度测定
• 3.3.2 转化外源基因对菌株影响
• 3.3.3 ATPase 酶活测定方法
• 3.4 小结
• 4 PtDRG01 基因的遗传转化体系建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 高效叶片再生体系的建立及选择压的确定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 生长调节剂对叶片再生的影响
• 4.2.2 卡那霉素对叶片不定芽再生的影响及临界浓度确定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 影响毛白杨叶片再生不定芽的因素
• 4.3.2 环境抗生素浓度对转化筛选的影响
• 4.4 小结
• 5 基因枪介导遗传转化及对转基因无性系分子检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 重组子的准备
• 5.1.2 叶片受体材料的准备
• 5.1.3 基因枪转化流程
• 5.1.4 转基因无性系的筛选及扩繁
• 5.1.5 转基因无性系的分子检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 基因枪轰击参数对转化频率的影响
• 5.2.2 转化后的选择培养
• 5.2.3 转基因再生无性系的获得
• 5.2.4 分子检测结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 RNAi 技术
• 5.3.2 基因枪转化受体材料对转化率的影响
• 5.3.3 对转基因无性系的筛选
• 5.3.4 转基因分子检测手段的选择
• 5.4 小结
• 6 结论与研究展望
• 6.1 结论
• 6.1.1 PtDRG01 基因原核表达研究
• 6.1.2 PtDRG01 蛋白功能研究
• 6.1.3 PtDRG01 基因遗传转化研究
• 6.2 研究建议与展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢