高表达HPPCn转基因小鼠的鉴定及评价HPPCn在肝癌发生过程中的作用

论文摘要

本实验鉴定了高表达HPPCn转基因小鼠,为研究该基因在肝癌发生发展中的功能提供研究模型。同时利用高表达HPPCn转基因小鼠建立肝癌模型,并评价高表达HPPCn在肝癌发生过程中的作用。显微注射外源基因pGEM-a1b/his-HPPCn至FVB/N小鼠原核,注射受精卵移植到假孕受体出生个体。PCR和Southern blot鉴定转基因小鼠基因型,Western blot和Realtime-PCR检测转基因阳性和阴性小鼠肝脏HPPCn蛋白表达情况,HE染色和透射电镜观察的结果显示肝脏病理改变。采用高表达HPPCn转基因小鼠和野生型FVB/N小鼠,利用DEN诱导小鼠肝癌的发生,并分别采用21w长期低剂量诱导和3w短期高剂量诱导。长期模型中,在21w时一次性处死所有小鼠；短期模型中,分别在24h,48h,1w,3w各处死6只小鼠。取一部分小鼠肝脏用来提取蛋白和RNA,一部分用中性甲醛固定送做切片,用免疫印迹、PCR、Q-PCR等方法对建模情况予以评价。经检测,显微注射共产生2只首建鼠,转入的重组HPPCn基因能在肝脏中特异表达,并能够稳定遗传。转基因小鼠肝脏内HPPCn含量明显增高。转基因后并未对小鼠造成不良影响。成功建立了转基因鼠和野生型鼠的肝癌模型,转基因小鼠的死亡率明显低于野生型小鼠,DEN刺激前期,HPPCn表达变化趋势较大,后期趋于稳定。HPPCn参与了肝癌发生发展的过程,在体内水平上验证了HPPCn在早期的肝损伤中具有明显保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 课题背景
• 1.1 原发性肝癌的现状
• 1.2 小鼠模型的应用
• 1.3 显微注射法制备转基因小鼠
• 1.3.1 实验动物的选择
• 1.3.2 胚胎操作
• 2 研究现状
• 2.1 细胞生长因子及其信号异常与肝癌靶向治疗
• 2.2 新型肝细胞刺激因子HPPCn的发现
• 2.3 HPPCn及其激活的信号系统与肝癌的关系
• 2.4 HPPCn与肝癌发生发展的科学问题
• 第一章 高表达HPPCn转基因小鼠的鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 引物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 仪器设备
• 1.5 试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 PCR和Southern blot鉴定转基因小鼠
• 2.1.1 PCR鉴定
• 2.1.2 Southern blot鉴定
• 2.2 Western blot检测His标签和HPPCn的表达
• 2.2.1 小鼠肝脏总蛋白和各组织总蛋白的提取
• 2.2.2 抗His标签和抗HPPCn肝脏和各组织总蛋白WB检测
• 2.3 Realtime-PCR检测HPPCn mRNA的表达
• 2.3.1 小鼠肝脏总RNA的提取
• 2.3.2 Q-PCR检测小鼠肝脏总RNA中HPPCn相对表达量
• 2.4 组织学检测
• 3 实验结果
• 3.1 高表达HPPCn转基因小鼠的鉴定
• 3.2 WB检测HPPCn在转基因阳性和阴性小鼠肝脏中的表达
• 3.3 Q-PCR检测HPPCn mRNA在转基因阳性和阴性小鼠肝脏中的表达
• 3.4 WB检测高表达HPPCn转基因小鼠在体内各组织表达特异性
• 3.5 HPPCn高表达转基因小鼠肝脏组织病理学检测
• 4 讨论
• 第二章 转基因小鼠肝癌模型的诱导及其评价
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 引物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 仪器设备
• 1.5 试剂配制
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠肝癌诱导建模操作步骤
• 2.2 血液处理
• 2.3 新鲜肝脏组织RNA提取及相关基因Q-PCR检测
• 2.3.1 小鼠肝脏总RNA的提取
• 2.3.2 Q-PCR检测小鼠肝脏总RNA中HPPCn相对表达量
• 2.4 小鼠肝脏蛋白的提取及原癌基因和肿瘤标志物的WB检测
• 3 实验结果
• 3.1 小鼠肝癌诱导长期模型存活率
• 3.2 肝脏损伤和肿瘤发生情况
• 3.3 肝脏组织病理分析
• 3.4 各组小鼠建模过程体重的变化
• 3.5 血清中ALT的检测
• 3.6 Q-PCR检测两组小鼠肝脏中HPPCn表达
• 3.7 肿瘤标志物和原癌基因的检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩微词表
• 致谢
• 作者简历