洛伐他汀对人肺腺癌细胞A549的体外作用及其机制研究

论文摘要

目的:研究胆固醇合成抑制剂洛伐他汀（Lovastatin,LOV）对人肺腺癌细胞A549体外抗增殖和诱导凋亡作用,观察LOV联合顺铂（Cisplatin）对A549细胞体外作用的影响,并探讨其可能的分子机制。方法:1常规体外培养人肺腺癌细胞A549,采用四甲基偶氮唑蓝（tetrzolium-based colorimetric assay, MTT）法检测LOV不同浓度组（0、2、5、10、20、32、50、64umol/L）、不同时间组（24、48、72h）对细胞存活和生长的影响,从而选择适当的药物浓度及作用时间。根据MTT结果,设置对照组及实验组（2、5、10、20 umol/L）。流式细胞仪（flow cytometry,FCM）测定LOV对A549细胞周期分布和凋亡的影响,光学显微镜观察细胞形态学改变。分别提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性及含量,通过反转录—聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）半定量检测LOV处理前后A549细胞中p27、PTEN基因mRNA的表达水平。采用流式细胞仪间接免疫荧光技术半定量检测LOV处理前后A549细胞中p27、PTEN蛋白的表达水平。2采用MTT比色法检测LOV与抗癌药物顺铂联合应用对A549细胞的增殖抑制作用,采用金氏公式分析相互作用指数（Interaction Index）,评价联合后的作用;流式细胞仪检测LOV联合不同浓度顺铂对细胞凋亡的影响。结果:1 MTT结果显示:LOV（0、2、5、10、20、32、50、64umol/L）对A549细胞具有抑制增殖的作用。不同浓度LOV处理细胞24～72h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度的下降,差异具有显著性（P<0.05）。且随着LOV处理浓度的增大、作用时间的延长,OD值逐渐下降,即LOV对A549细胞的增殖抑制作用有明显的剂量—效应和时间—效应依赖关系。LOV作用A549细胞后,有明显的细胞形态学改变:未经药物作用的细胞呈多形性或梭形,形态饱满,而用药组细胞缩小,细胞核固缩,细胞突起减少,胞体折光性减弱,胞浆内可见有颗粒。随LOV浓度和处理时间延长,细胞可变圆脱壁,部分细胞胀大破裂。流式细胞术检测A549细胞周期分布和凋亡显示,0、2、5、10、20umol/L LOV作用A549细胞48h后,随药物浓度增大,G0/G1期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少。即LOV可阻滞A549细胞周期进程于G0/G1期,该作用呈剂量—效应依赖关系。0、2、5、10、20umol/L LOV作用A549细胞48h后,出现典型的亚二倍体凋亡峰,依A549细胞浓度增大而逐渐增高;最大凋亡率为34.02%。流式细胞仪间接分析PTEN、p27蛋白表达显示:0、2、5、10、20umol/L LOV作用A549细胞48h后,PTEN和p27的荧光指数FI值均随处理浓度增大而逐渐增大。对于每一种蛋白,比较其处理组和对照组的FI值,差异具有显著性（P<0.05）。半定量RT-PCR检测结果显示:洛伐他汀处理前A549细胞PTEN、p27基因均表达阳性。与对照组相比,经LOV处理的A549细胞中PTEN、p27 mRNA表达明显升高（P<0.05）。PTEN、p27在mRNA水平及蛋白表达水平均呈明显正相关（P<0.05）。2 MTT比色法分析LOV联合顺铂对A549细胞的增殖抑制作用,结果显示:2、5umol/L的LOV可加强顺铂对A549细胞的增殖抑制作用。金氏公式分析相互作用指数显示,不同浓度顺铂联合2、5umol/L的LOV的q值均大于0.85。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示,2、5umol/L LOV与不同浓度顺铂联合作用细胞48h后,细胞凋亡百分率随顺铂浓度增高而增大,与对照组比较差异具有显著性（P<0.05）,且与顺铂组比较差异具有显著性（P<0.05）。结论:1 LOV对人肺腺癌A549细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。2 LOV抑制A549细胞增殖的作用呈时间—剂量依赖关系。3本实验证明LOV可阻滞A549细胞于G0/G1期并可诱导细胞凋亡。4一定浓度的LOV能够在mRNA转录水平和蛋白水平提高PTEN及p27表达。初步推论LOV通过上调PTEN和p27mRNA转录、蛋白的表达而发挥其抑制肺癌A549细胞增殖、诱导凋亡的作用。5 LOV可协同顺铂对A549细胞的增殖抑制作用。6 LOV可强化顺铂诱导A549细胞凋亡的作用,推测LOV可增加A549细胞对化疗药的敏感性。

论文目录

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• 研究论文 洛伐他汀对人肺腺癌细胞A549 的体外作用及其机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
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