论文摘要
在寻找新型造血调控基因时,从小鼠骨髓造血基质细胞中通过抑制性差减杂交（SSH）技术筛选获得的一条新基因,即mL52号基因,由于mL52基因与人的基因具有100%的同源性,因此人的该同源基因命名为hL52基因。 本研究是以前期的基因序列及蛋白质结构等研究为基础,主要目的是揭示该基因的功能,研究hL52基因表达产物的生物学作用。根据DNAStar软件对其蛋白质序列进行的结构分析推测其可能为一种抗菌肽。但hL52是否是抗菌肽基因,还未得到证明,本实验通过hL52特异蛋白表达、抑菌实验、转基因等方法对其功能进行研究。 1.通过SDS-PAGE试图获得hL52的特异性表达蛋白。将hL52基因连接在pET22b（+）的载体上,并将连接好的载体转化到大肠杆菌BL21中,同时用空载体pET22b（+）做阴性对照。将pET22b（+）—hL52（no tag）转化后的BL21涂于含有氨苄的琼脂板,进行筛选,挑长出的克隆进行培养,提质粒并进行酶切鉴定,选一个阳性克隆和一个阴性克隆,再选一个转入空载的克隆,每个克隆再分成两部分,一部分在摇菌过程中加入IPTG诱导,一部分不加IPTG,一段时间后将菌液离心,弃上清收沉淀,加细胞裂解液将菌裂解,将裂解液做SDS-PAGE,结果没有发现诱导后的BL21有特异条带的产生。说明hL52基因的表达产物在产生后可能立即发挥其生物学作用从而被迅速降解,故无法在PAGE胶上看到特异的蛋白表达条带。 2.验证HL52蛋白是否具有抑菌作用。将pET22b（+）—hL52（no tag）转化后的BL21阳性克隆进行液体培养,在培养过程中加IPTG诱导该基因的表达,实验通过多组对照以大肠杆菌的生长是否受到抑制,证明hL52基因的表达产物的抗菌活性。实验结果显示,pET22b（+）—hL52（no tag）转化后的BL21经IPTG诱导后,大肠杆菌BL21的生长明显地受到抑制,证明hL52基因的表达产物确具有抗菌活性。 3.hL52基因的表达产物对真核细胞的作用。在胞外即细胞培养液中加入含有HL52蛋白的酵母上清。选用毕赤酵母（Pichia）构建了酵母生物反应器,将pPIC9K—hL52转入毕赤酵母中,向培养液中加入甲醇,可诱导产生外源基因hL52的表达蛋白,离心取培养液上清,将该上清加到生长状态良好的真核细胞HepG2的培养液中,并以HepG2细胞培养液中不加酵母上清,和HepG2细胞培养液中加不