组织蛋白酶D(Cathepsin D)的作用机制研究

论文摘要

组织蛋白酶D （Cathepsin D, CD）是一种重要的蛋白水解酶,它不仅在溶酶体内降解蛋白质,还能分泌至细胞外发挥作用。在多种肿瘤、乃至肿瘤患者的血液中都发现了高丰度的CD。一般认为,CD通过剪切细胞外基质蛋白而促进肿瘤细胞的侵袭和转移,但CD的剪切特征性及底物选择性仍不十分清楚。本研究试图以天然蛋白质为底物、利用蛋白质组学技术鉴定CD的剪切位点,进而系统地分析CD识别位点和底物选择特征性。我们构建了A549 CD-knockdown的稳定细胞株,收集了A549和A549 CD-knockdown细胞的分泌蛋白质。通过双向电泳、Western blot和质谱分析,我们验证了在A549CD-knockdown细胞中CD丰度呈显著下降,而且在分泌蛋白中也没有发现可检测的CD。通过细胞迁移实验,我们观察到CD-knockdown抑制了A549细胞的迁移能力,再次证实了CD影响了肿瘤细胞的侵袭和转移,从而明确了鉴定CD酶切特征的必要性。我们以牛血清白蛋白（BSA）为典型的CD底物蛋白,采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测CD在该蛋白质上的剪切位点。CD在BSA上的剪切位点中,P1位置（肽段碳端的第一位氨基酸）上的疏水氨基酸出现频率较高,同时P1’位置（肽段氮端的第一位氨基酸）上氨基酸的疏水性也影响了CD对位点的识别。我们首次提出了比邻氨基酸的疏水值（the Hydrophobic Scores of Neighbors, HSN）用以描述CD剪切位点的疏水微环境；HSN数值越高,相应位点被CD剪切的可能性越大。我们以卵清白蛋白（OVA）为典型的CD非剪切蛋白,天然状态OVA不能被CD剪切；但变性OVA则容易被CD剪切。重要的是,CD在变性OVA上的剪切特点与在BSA上的剪切特征基本一致：HSN数值越高的位点被CD剪切的可能性越大,这表明一旦CD能够进入到OVA分子内部,HSN则成为OVA能否被CD水解的重要判据之一我们选取了常用的CD底物、三种同源家族蛋白质、自水解蛋白质作为研究对象来分析HSN是否具有普适性。结果表明,CD在这些蛋白质上的识别特征十分相似,都是亮氨酸和苯丙氨酸在P1出现频率最高；同时,HSN也是CD剪切与否的一个敏感判据,HSN0.5～1.0是判断位点能否被CD剪切的阈值范围。利用双向电泳和质谱技术,我们在A549 CD-knockdown细胞中发现核苷二磷酸激酶A（NDKA）、硫氧还蛋白（Trx）、脂肪酸结合蛋白（FABP5）和肌动蛋白辅助蛋白（COTL1）均不易被CD剪切。我们对CD易/不易剪切蛋白质的二级结构和空间结构进行了分析,发现属于all α-helix结构的蛋白质一定是CD易剪切底物,而all β-sheet结构的蛋白质则基本不易被CD剪切。我们推断,CD酶解的先决条件是蛋白质空间结构能够允许CD接近剪切位点；满足该条件后,则HSN的大小决定CD识别位点。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 专业词汇中英文对照表
• 第一章 绪论
• 1.1 Cathepsin D与疾病
• 1.1.1 CD与阿尔茨海默病相关
• 1.1.2 CD参与动脉粥样硬化症的发生
• 1.1.3 CD参与肿瘤的发生发展
• 1.1.3.1 CD作为肿瘤标志物
• 1.1.3.2 CD的有丝分裂原作用
• 1.1.3.3 CD在血管生成中的作用
• 1.1.3.4 CD促进肿瘤细胞的侵袭和转移
• 1.2 CD的生物学功能
• 1.2.1 CD的翻译与转运
• 1.2.2 CD的分布
• 1.2.3 CD剪切、降解多种蛋白质和多肽
• 1.2.4 CD参与细胞凋亡
• 1.2.4.1 CD促凋亡的作用
• 1.2.4.2 CD抗凋亡的作用
• 1.2.5 CD参与自噬过程
• 1.2.6 CD参与细胞老化
• 1.2.7 水解酶催化特征是CD研究的核心内容之一
• 1.3 蛋白酶的底物与剪切位点的研究策略
• 1.3.1 蛋白酶的底物鉴定方法
• 1.3.1.1 相对和绝对定量的同重标记法
• 1.3.1.2 双向凝胶电泳和双向差异凝胶电泳法
• 1.3.1.3 质谱导向的数据采集法
• 1.3.1.4 同位素编码亲和标签法
• 1.3.2 蛋白酶的剪切位点鉴定方法
• 1.3.2.1 基于赖氨酸胍基化的蛋白质N-末端的生物素化法
• 1.3.2.2 底物的末端胺同位素标记法
• 1.3.2.3 iTRAQ分析N-末端法
• 1.3.2.4 联合分离对角线层析法
• 1.4 CD底物和剪切位点的研究现状
• 第二章 Cathepsin D knockdown降低肿瘤细胞的迁移能力
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 人CD基因siRNA质粒的构建
• 2.3.2 CD基因knockdown稳定细胞株的筛选
• 2.3.3 A549 CD-knockdown细胞分泌蛋白的双向电泳分析
• 2.3.4 Western blot检测A549 CD-knockdown细胞分泌蛋白中的CD
• 2.3.5 A549 CD-knockdown细胞运动和侵袭能力的变化
• 2.4 小结
• 第三章 Cathepsin D在BSA和OVA上剪切位点及特征性的分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 LC-MS/MS检测蛋白酶剪切位点的可行性和准确性
• 3.3.1.1 LC-MS/MS检测胰蛋白酶的剪切位点
• 3.3.1.2 Sequence logo绘制胰蛋白酶剪切位点特征性
• 3.3.2 多种底物与CD的酶促反应
• 3.3.3 CD在BSA上剪切位点及特征性分析
• 3.3.3.1 CD对BSA的水解呈现时间依赖性
• 3.3.3.2 CD在BSA上的剪切位点特征性分析
• 3.3.3.3 CD剪切位点的疏水性分析
• 3.3.3.4 比邻氨基酸的疏水值（the hydrophobic scores of neighbors）的分析
• 3.3.3.5 剪切组C-HSN和未检测组U-HSN的对比分析
• 3.3.4 CD在OVA上剪切位点及特征性分析
• 3.3.4.1 CD不剪切天然OVA
• 3.3.4.1.1 延长酶促反应时间不能促进CD对天然OVA的剪切
• 3.3.4.1.2 反应条件变化均不能促进CD对天然OVA的剪切
• 3.3.4.2 CD剪切变性的OVA
• 3.3.4.3 变性OVA的时间依赖性水解
• 3.3.4.4 CD在变性OVA上剪切位点的特征性分析
• 3.3.4.5 CD在变性OVA上剪切位点的疏水性分析
• 3.3.4.6 比邻氨基酸的疏水值（the hydrophobic scores of neighbors）的分析
• 3.3.4.7 剪切组C-HSN和未检测组U-HSN的对比分析
• 3.4 小结
• 第四章 Cathepsin D在多个蛋白质上的剪切位点及其特征性分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 CD对多种蛋白质的剪切情况
• 4.3.2 CD在多种蛋白分子中剪切位点的检测
• 4.3.3 CD在多种蛋白底物上剪切位点的特征性分析
• 4.3.4 CD剪切位点数据库的构建与分析
• 4.3.5 基于CCPD的CD剪切位点疏水性分析
• 4.3.5.1 CD剪切位点附近12个位置上氨基酸的疏水性的分析
• 4.3.5.2 对P1和P1’位置上氨基酸的疏水性的分析
• 4.3.5.3 HSN的分析
• 4.3.5.4 CCPD中C-HSN与U-HSN的对比分析
• 4.3.6 CD在同源蛋白质上的剪切位点具有保守性
• 4.4 小结
• 第五章 分析cathepsin D底物识别特征性
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 CD消化前后的胞浆蛋白质的双向凝胶电泳分离
• 5.3.2 蛋白质组图谱的分析
• 5.3.3 不被CD剪切的蛋白点的质谱鉴定
• 5.3.4 分析一些蛋白质不被CD剪切的原因
• 5.4 小结
• 第六章 讨论
• 6.1 研究CD在天然蛋白底物中剪切位点的必要性
• 6.2 液相色谱-串联质谱（LC-MSMS）与双向电泳（2DE）
• 6.3 CD在蛋白质中的剪切位点特征性
• 6.4 Hydrophobic scores of neighbors（HSN）的意义
• 6.5 CD底物选择特征性——蛋白质空间结构的影响
• 6.6 HSN与蛋白质空间结构在决定蛋白质对CD敏感性时的关系
• 6.7 其他天冬氨酸蛋白酶的剪切位点的HSN分布
• 6.8 CD在肿瘤发生发展中的作用和机制
• 基本结论
• 参考文献
• 附表 Cathepsin D剪切肽段库（CCPD）
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果