论文摘要
从新疆低温环境中筛选到一株可产低温乳糖酶的菌株14-1,利用形态学方法,生理生化实验、16S rDNA基因序列同源性比对及系统发育树构建对菌株进行鉴定,结果显示该菌属于水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）,命名为Rahnella aquatilis sp.14-1。对低温乳糖酶产生菌Rahnella aquatilis sp.14-1进行了摇瓶条件下产低温乳糖酶的研究,确定了摇瓶最佳发酵工艺:乳糖含量为2.5%,接种量3%,培养基初始pH为6.5,装液量为在500 mL三角瓶装液体培养基100 mL。20℃,200 r·min-1摇床培养48 h,14-1菌产低温乳糖酶活性4.51 U·mL-1。Rahnella aquatilis14-1 sp.乳糖酶为胞内酶,将菌体用超声波破壁提取粗酶液,用硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-25和DEAE-Cellulose柱层析进一步纯化。经过纯化的酶用SDS-PAGE检验其纯度,结果为电泳单条带,该酶的单亚基表观分子量约为60 KDa。酶的纯化倍数为4.19,回收率25%。Rahnella aquatilis sp.14-1乳糖酶的酶学性质研究表明,以ONPG为底物,酶的最适反应温度为35℃,对热敏感,45℃保温2 h,酶完全失去活力;最适反应pH值为6.5～7.0,在pH值低于5和高于9酶不稳定。。金属离子Mn2+对酶有激活作用,活力提高了19.8%。而Cu2+、Zn2+、Fe3+、Al3+离子对酶活力有明显的抑制作用,其活力分别减少了94.35%、92.76%、71.98%和88.93%。K+、Li+、Mg2+、Na+和Ca2+对酶活力的影响很小。Rahnella aquatilis sp.14-1乳糖酶水解牛乳中的乳糖,35℃水解2 h,乳糖水解率达到80%以上。
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摘要Abstract第一章 文献综述1.1 低温微生物及低温酶1.2 乳糖酶概述1.3 低温乳糖酶的研究1.3.1 低温乳糖酶产生菌的分离鉴定1.3.2 低温乳糖酶的酶学性质1.3.3 低温乳糖酶的结构及人工进化1.3.4 低温乳糖酶的应用1.4 本研究的内容和方法1.4.1 研究内容1.4.2 研究方法第二章 方法与材料2.1 材料2.1.1 样品采集2.1.2 主要培养基2.1.3 主要药品2.1.4 主要仪器设备2.2 方法2.2.1 菌株筛选方法2.2.2 乳糖酶活力的测定方法2.2.3 菌株的鉴定分类方法2.2.4 菌株的最适生长温度的测定方法2.2.5 实验室工艺研究方法2.2.6 酶的分离纯化方法2.2.7 酶纯度的检测方法2.2.8 酶学性质的研究方法2.2.9 牛乳中乳糖水解率的测定方法第三章 低温乳糖酶产生菌的分离筛选和鉴定3.1 低温乳糖酶产生菌的分离筛选3.1.1 菌株的平板初筛3.1.2 菌株的摇瓶复筛3.2 低温乳糖酶产生菌 14-1 的鉴定和分类3.2.1 形态和培养特征3.2.2 生理生化实验3.2.3 16S rDNA 的 PCR（聚合酶链式反应） 扩增和测序3.2.4 系统发育分析3.2.5 菌株的温度生长特性3.3 讨论3.4 小结第四章 低温乳糖酶产生菌产酶条件的研究4.1 酶的表达方式4.1.1 乳糖酶活性标准曲线的绘制4.1.2 酶的表达方式4.2 菌株产酶的实验室工艺研究4.2.1 产酶最佳温度和产酶时间4.2.2 乳糖含量对 14-1 产酶的影响4.2.3 培养基初始pH 对产酶的影响4.2.4 接种量对菌株产酶的影响4.2.5 装液量对菌株产酶的影响4.3 讨论4.4 小结第五章 低温乳糖酶的分离纯化及其酶学性质的研究5.1 酶的分离纯化5.1.1 绘制蛋白质标准曲线5.1.2 粗酶液的制备4）2SO4 分级沉淀'>5.1.3 （NH4）2SO4分级沉淀5.1.4 Sephadex G-25 分子筛层析5.1.5 DEAE-Cellouse柱层析5.1.6 SDS-PAGE 检验纯化结果5.2 酶学性质5.2.1 酶的最适温度和热稳定性 5.2.2 酶的最适 pH 和 pH 的稳定性5.2.3 金属离子对酶活的影响5.2.4 底物浓度对乳糖酶水解速率的影响——K m 的测定5.2.5 乳糖酶水解牛乳中乳糖的研究5.3 讨论5.4 小结第六章 结论与展望6.1 结论6.2 本研究的创新点6.3 展望参考文献附录致谢作者简介导师评阅表
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