马唐生防菌Col-68（Colletotrichum sp.）生物学特性研究及遗传改良

论文摘要

马唐是世界18种恶性杂草之一,目前的防治主要以化学除草剂为主。但是,随着化学除草剂的广泛应用,随之而来的环境污染、杂草耐药性提高等问题也日益加重。生物防治因其对环境友好和高度选择性等优点逐步成为研究热点。本实验室从马唐罹病叶片上分离得到炭疽病病原菌Col-68（Colletotrichum sp.）,前期试验研究表明,该菌对马唐具有很强的致病力,但并不侵染水稻、棉花、玉米、大豆、小麦、花生等经济作物及主要草坪草,具有很高的生物安全性。为明确该菌的生理特性,更好的利用该菌开展生物防治,对其生物学特性进行了研究,并进行了遗传改良。生物学特性分析结果表明,菌丝体在15-35℃均可生长和产孢,在马唐汁培养基上生长最好,5天后菌落直径为8.01 cm,在PSA培养基上产孢最多,15天后产孢量可达5.55×106个/皿；该菌株最适生长和产孢的温度及初始pH值均为28℃和6.5,光照有利于产孢。分生孢子萌发最适温度为35℃,最适初始pH值为6.5,黑暗有利于孢子萌发；分生孢子温热致死温度和时间为53℃/10 min。通过不同液体培养基发酵培养,发现该菌在麸皮液体培养基中产孢最好,3天后产孢量可达106个/mL。综上所述,马唐致病真菌Col-68生长条件广泛,并且具备良好的发酵条件,已经具备了真菌除草剂候选菌株的基本条件,是马唐生防菌的潜力菌株。为了提高菌株Col-68的产孢量和生防效果,采用紫外诱变和根癌农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT）的方法对菌株Col-68进行遗传改良。通过紫外诱变,从153个稳定的诱变菌株中筛选到产孢能力增强菌株1株（ZW84）,其产孢量可达107个/皿;此外通过致病性测定,筛选到对马唐生防效果增强菌株6株（ZW8,ZW15,ZW17,ZW49,ZW61,ZW84）,其中ZW84对马唐的防除效果最佳。通过农杆菌介导转化,经过潮霉素的二次筛选,共获得约200个稳定遗传的转化子,转化效率为平均每106个分生孢子可得到150-200个转化子。对随机挑取的转化子进行PCR检测、荧光观察和Southern杂交检测结果表明T-DNA已经成功插入到炭疽病菌的基因组中。通过生物学特性分析,筛选到产孢量增强菌株2株（ZH12和ZH18）,其中ZH18的产孢量达到107个/皿。此外,致病性测定结果表明,ZH2,ZH16,ZH18,ZH22和ZH23这5株转化菌株的生防效果均比野生型高。将这11株突变菌株作为工业生产候选菌株,为进一步开发研究该菌成为工程菌和进行工业化生产打下基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 目录
• 第一部分 文献综述
• 第一章 微生物除草剂的研究进展
• 1 活体微生物除草剂的研究进展
• 1.1 真菌除草剂的研究进展
• 1.2 细菌及病毒微生物除草剂的研究进展
• 2 农用抗生素除草剂的研究进展
• 3 杂草生物防治的局限性
• 3.1 寄主单一性的限制
• 3.2 环境因子及制剂的影响
• 3.3 菌种退化,工业化生产难
• 4 马唐生防菌的研究进展
• 第二章 菌种遗传改良的研究进展
• 1 诱变技术在菌种改良中的应用
• 1.1 化学诱变
• 1.2 物理诱变
• 2 生物技术在菌种改良中的应用
• 2.1 原生质体转化
• 2.2 电转化法
• 2.3 限制性内切酶介导整合技术
• 2.4 农杆菌介导的转化（ATMT）
• 第三章 本课题研究目的及意义
• 第二部分 研究内容
• 第一章 马唐生防菌Col-68（Colletotrichum sp.）生物学特性
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 不同环境因子对菌株Col-68菌丝生长及产孢的影响
• 2.3 不同环境因子对菌株Col-68分生孢子萌发试验
• 2.4 菌株Col-68液体发酵培养基的选择
• 2.5 数据统计与分析
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第二章 马唐生防菌Col-68（Colletotrichum sp.）紫外诱变改良
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 孢子悬浮液的配制
• 2.3 紫外辐射敏感性测试
• 2.4 紫外诱变处理
• 2.5 诱变突变体保存
• 2.6 对诱变突变体生物学性状分析
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株对紫外辐射的敏感性测试结果
• 3.2 紫外诱变处理菌株Col-68试验结果
• 3.3 对诱变菌株生物学性状分析结果
• 4 讨论
• 第三章 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的马唐生防菌Col-68（Colletotrichum sp.）转化及致病突变体筛选
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 供试菌株、质粒与培养条件
• 2.2 培养基的配制
• 2.3 载体构建与引物设计
• 2.4 农杆菌的冻融法转化
• 2.5 马唐炭疽病菌菌株Col-68的T-DNA转化
• 2.6 菌株Col-68的DNA提取与转化子的检测
• 2.7 转化子的生物学特性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 马唐炭疽病病菌转化子的获得
• 3.2 转化子的检测
• 3.3 转化子生物学性状分析结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录A
• 1 质粒pBIG2RHPH2-GFP-GUS
• 2 菌株Col-68潮霉素敏感性测定
• 3 ATMT转化子潮霉素二次筛选
• 附录B 马唐种子消毒与催芽
• 附录C 常规分子生物学实验技术
• 1 真菌DNA提取（CTAB法）
• 2 农杆菌冻融法转化
• 3 PCR反应
• 3.1 PCR体系
• 3.2 PCR反应
• 4 Southern杂交酶切反应体系
• 5 DNA的琼脂糖电泳
• 6 DNA片段的凝胶回收
• 7 Southern杂交分析
• 7.1 试剂的配制
• 7.2 DIG-DNA探针标记
• 7.3 马唐炭疽病菌Col-68基因组DNA的消化、电泳及变性
• 7.4 DNA转膜
• 7.5 Southern杂交过程
• 7.6 免疫显色
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢