小剂量雌激素对癫痫大鼠行为学、海马神经元损伤及炎症相关作用研究

论文摘要

雌激素在诸多急慢性神经系统疾病中发挥神经保护作用。本课题组前期在海人酸（kanic acid, KA）尾静脉注射癫痫模型中观察到苯甲酸雌二醇（EB）干预可减轻癫痫持续状态（status epilepticus, SE）后海马CA1、CA3和门区（hilus区）神经元缺失,这在其他癫痫模型中也得到了证实。雌激素神经保护作用的具体机制目前认为主要包括神经营养作用、抗凋亡作用和抗炎作用。在癫痫中研究最多的是雌激素的神经营养作用,对其抗炎作用研究甚少,而免疫炎症机制在癫痫中的作用越来越受重视。化学致痫剂、电刺激等多种癫痫模型中均可观察到癫痫发作后快速诱导的炎症反应,主要包括小胶质细胞和星形胶质细胞活化、经典的炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6表达增加,同时伴随下游炎症级联反应（TLR、NF-κB.补体、趋化因子、CRP等）产生。炎症反应在一定程度上促进了癫痫发作病理生理进程,并可导致癫痫相关的海马病理性改变,如神经元死亡和再生、胶质细胞再生、苔藓纤维发芽等。雌激素在脑外伤、卒中、神经变性疾病体内外研究中均观察到可通过抑制炎症反应发挥神经保护作用。由于大剂量雌激素副作用多,而目前关于大小剂量尚无明确界定,一般认为本实验选用的10μg/rat为小剂量雌激素,所以本课题旨在研究小剂量EB在匹罗卡品癫痫模型中对海马神经元损伤的影响及炎症反应在其中的作用,并对雌激素作用的受体机制进行初步探索。第一部分小剂量雌激素对去势雌性大鼠癫痫行为学及海马神经元损伤影响目的：观察小剂量EB预处理对去势雌性大鼠癫痫行为学及海马神经元损伤的影响。方法：成年雌性SD大鼠阴道涂片确定有2个正常生理周期后行双侧卵巢摘除,术后饲养1w,第8d随机分成对照组（Control组）、致痫组（Pilocarpine组）、雌激素干预组（EB组）、雌激素干预后致痫组（Pilo+EB组）。根据不同分组分别给予10μg/0.1ml EB或0.1ml芝麻油皮下注射连续4d。末次给药后6h进行匹罗卡品（320mg/kg, i.p.）致痫或等量生理盐水腹腔注射。记录癫痫发作潜伏期、重型发作潜伏期、死亡率,SE后8h、24h处死,心脏采血2m1离心取血清,大鼠灌注取脑制备冰冻切片。电化学发光法检测SE后24h各组血清雌二醇（E2）浓度以监测体内雌激素状态。尼氏染色观察癫痫后不同时间点海马CA1、CA3、hilus区神经元形态及分布情况,Fluoro-Jade B （FJB）染色和NeuN免疫荧光染色分别评估神经元变性和存活情况。结果：1、本实验部分致痫大鼠35只,4只大鼠致痫失败,余大鼠均达4/5级反复发作（SE）。小剂量EB干预后大鼠癫痫发作的潜伏期和重型发作潜伏期缩短,SE后8h、24h存活率增加,但差异均无统计学意义。2、SE后24h外周血E2浓度检测显示EB干预可导致血E2浓度明显升高（与Control组相比,P<0.01）,约为动情前期E2水平（122.8+9.19pmol/L）的2.5倍,痫性发作对血E2浓度无明显影响。3、尼氏染色显示致痫后8h组海马各亚区锥体细胞排列整齐,结构完整,与未致痫组相比胞体略小,胞浆中央淡染区不明显。致痫后24h组海马CA1、CA3和hilus区均可见胞膜破裂、尼氏小体外露等。4、FJB染色显示未致痫组和致痫8h组染色阴性,致痫后24h组则表现为FJB阳性染色。小剂量EB干预可导致SE后24h海马hilus区FJB阳性细胞明显减少（P<0.05）,对CA1、CA3区无明显作用。5、SE后8h海马各亚区NeuN阳性细胞较对照组无明显减少,SE后24h, Pilocarpine组海马各亚区及Pilo+EB组CA1和CA3区NeuN阳性细胞数分别较Control组和EB组少,具有统计学意义,其中Pilocarpine组海马hilus区NeuN阳性细胞较Pilo+EB组明显减少（P<0.01）。结论：小剂量EB （10μg/rat）皮下注射连用4天,可使血清E2水平持续（>30h）维持在动情前期水平2.5-3倍之上,癫痫发作本身对大鼠血清E2水平无显著影响；小剂量EB对匹罗卡品癫痫发作潜伏期及重型发作潜伏期无明显影响,仅在一定程度减少SE后死亡率,但差异尚无显著统计学意义；匹罗卡品诱导的SE持续1h即可引起海马各亚区神经元迟发性变性（SE后24h）,小剂量EB预处理可明显减少SE后海马hilus区神经元迟发性死亡。第二部分小剂量雌激素对去势雌性大鼠癫痫发作后海马炎症反应影响目的：观察小剂量EB干预在雌性去势大鼠癫痫发作后海马炎症反应中的作用。方法：参考第一部分制备动物模型,SE后8h、24h处死心脏采血、完整剥离海马组织。全血离心取血清,选右侧海马组织加0.01MPBS匀浆取上清液。酶联免疫吸附法测定血清和海马匀浆上清液中IL-1β和TNF-a含量。另取第一部分脑片行CDllb和GFAP免疫荧光染色,观察脑内小胶质细胞和星形胶质细胞形态与数量变化,比较各组间胶质细胞活化程度。结果：1、匹罗卡品致痫可导致大鼠海马组织IL-1β和TNF-a含量增高,SE后8h明显,24h恢复至对照组水平,SE后8h Pilocarpine组海马IL-1β和TNF-α水平分别为对照组的226%、261%。小剂量EB可明显下调SE后8h海马组织IL-1β表达,对TNF-a表达作用不明显。2、匹罗卡品导致的痫性发作及小剂量EB干预对外周血IL-1β和TNF-α表达无明显影响。3、癫痫发作可诱导脑内小胶质细胞和星形胶质细胞活化,SE后8h即可观察到,SE后24h更为明显,表现为胞体变大,分枝变粗,小胶质细胞完全活化后呈现出“阿米巴样”。小剂量EB干预可减少SE后8h、24h海马hilus区小胶质细胞活化,对CA1、CA3区小胶质细胞活化无明显作用。SE后24h海马CA3区活化星形胶质细胞表达Pilo+EB组明显减少（与Pilocarpine组相比,P＜0.05）, CA1 hilus区两组间无明显差异（P>0.05）；SE后8h两组海马各亚区活化星形胶质细胞数均无明显差异。结论：癫痫发作可引起脑内胶质细胞活化、IL-1β和TNF-α表达增加,对外周血IL-1β和TNF-α表达无明显影响。小剂量EB干预可减少SE后海马IL-1β表达、海马hilus区小胶质细胞活化及海马CA3区星形胶质细胞活化。本部分研究提示小剂量EB干预可以抑制匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马炎症反应。第三部分小剂量雌激素对去势雌性大鼠癫痫发作后海马雌激素受体表达影响目的：观察小剂量EB干预对去势雌性大鼠致痫后海马雌激素受体表达的影响。方法：选用第二部分实验中留取的左侧海马,加细胞总蛋白提取液,匀浆取上清液,免疫印迹法检测上清液中ERa和ERp表达。结果：1、SE后8h, Pilocarpine组和Control组相比ERa表达相似,小剂量EB干预后ERa表达有所降低,但差异无统计学意义。SE后24h,各组大鼠海马匀浆ERa表达仍无明显差异。匹罗卡品导致的痫性发作和小剂量EB干预对SE后8h、24h海马ERa表达均无明显影响。2、SE后8h, Pilocarpine组海马ERβ表达较对照组有降低趋势,小剂量EB干预后ERβ降低更为明显,但各组之间差异尚无统计学意义。SE后24h,Pilo+EB组海马匀浆ERβ表达较EB组和Pilocarpine组明显降低（P值分别<0.01和<0.05）,余组间比较无统计学差异。结论：匹罗卡品导致的痫性发作和小剂量EB干预对SE后8h、24h海马ERa表达均无显著影响,对SE后8h海马ERβ表达也无明显影响。小剂量EB干预对SE后24h未致痫鼠海马ERp表达无显著作用,但可明显降低致痫鼠海马ERβ表达。1.小剂量EB （10μg/rat）连用4d可使末次给药后的30h内去势大鼠体内E2水平持续维持在动情前期水平2.5倍之上,癫痫发作对血清E2浓度无显著影响；2.小剂量EB干预对匹罗卡品癫痫模型行为学改变（潜伏期、死亡率等）无明显影响,但可减少SE后24h海马hilus区神经元缺失；3.癫痫发作可导致海马内胶质细胞活化,IL-1β和TNF-α炎性细胞因子表达上调,对外周血IL-1β和TNF-α表达无明显影响。小剂量EB干预可明显减少海马hilus区小胶质细胞活化及CA3区星形胶质细胞活化,明显减少海马IL-1β表达,对海马TNF-α表达作用不明显。4.癫痫发作后快速诱导的炎症反应与海马迟发性神经元死亡有关,小剂量EB可能通过减轻海马炎症反应,减少SE导致的hilus区神经元死亡,其作用主要与海马ERp有关,未观察到ERa在其中发挥作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 海马和颖叶癫痫
• 2 雌激素和癫痫
• 3 炎症和癫痫
• 4 雌激素受体与癫痫
• 参考文献
• 第一部分 小剂量雌激素对去势雌性大鼠癫痫行为学及海马神经元损伤影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 小剂量雌激素对去势雌性大鼠癫痫发作后海马炎症反应影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 小剂量雌激素对去势雌性大鼠癫痫发作后海马雌激素受体表达影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 创新点和不足
• 综述
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢