利用转座诱变研究天蓝色链霉菌A3（2）的功能基因组

论文摘要

链霉菌产生丰富的次级代谢产物,后者广泛应用于医药、农业和畜牧业。天蓝色链霉菌是次级代谢调控研究的模式菌,本论文通过优化转座诱变载体开发链霉菌功能基因组研究的实验工具,并应用于天蓝色链霉菌全基因组水平的功能基因挖掘。首先,针对现有载体转座诱变效率低的问题,本研究一方面通过定点诱变、密码子优化、采取链霉菌高效表达启动子的方法,提高Tn5转座酶的转座活性及其在链霉菌中的表达量,另一方面通过采用最优转座子边界序列,构建出多个mini-Tn5转座子载体。其中pHL724和pHL734能在天蓝色链霉菌中高效转座,效率可达到10-6／cfu,每个接合转移平皿约300突变子。两个高效转座载体大部分序列相同,不同点是pHL724的大肠杆菌质粒复制子位于mini-Tn5外部,pHL734的大肠杆菌质粒复制子位于mini-Tn5内部。对随机选取的突变体基因组DNA进行Southern杂交,结果显示,每个突变子仅含有一个转座插入序列。突变子转座插入位点的拯救克隆、测序分析显示,转座插入后19 bp转座子边界序列完整,同时靶位点产生9 bp正向重复序列,属于典型的Tn5转座。为分析天蓝色链霉菌的功能基因组,利用pHL724构建出含有60,000突变子的天蓝色链霉菌A（3）2突变体库,挑选表型明显变化的突变体127株。其中38株经过拯救克隆、测序定位出转座插入位点,其中13株突变体分别在4个基因序列内有重复插入,而且同一基因插入的突变体表型相同。pHL724转座诱变得到的突变子,因转座序列中不含有ori基因,其转座插入位点的拯救克隆困难。所以,利用pHL734构建出含有50,000突变子的天蓝色链霉菌A（3）2突变体库,挑取有突变表型的突变子。共1478株表型特异突变子被挑取,全部通过拯救克隆、测序定位出转座插入位点。靶位点序列统计分析表明,Tn5转座插入具有轻微的19 bp靶位点偏爱性。1478株突变子中,725株的插入基因重复,重复插入基因240个。1478株突变体中白突变（whi）表型184株,光秃（bld）表型392株,actinorhodin（ACT）产量升高440株,ACT产量降低或不产的有579株。选取38株ACT高产且产孢正常菌株进行多亲本基因组重排,研究GS高产育种技术的可能理论基础。38株突变体的原生质体经过PEG介导的原生质体融合,融合产物稀释涂布到R5培养基上再生,对再生的克隆子进行两方面研究。一方面,研究细胞融合子遗传标签的重组率,挑取96个融合再生单菌落进行PCR检测,得到1株融合6个标签的融合子,1株5个标签的融合子,4株4个标签的融合子,15株3个标签的融合子,对这21株融合子的子代各20株PCR检测,均无重组个体,暗示虽然发生了原生质体融合,但融合子中遗传重组率很低。另一方面,从多亲本融合实验筛选出8株ACT最高产的融合子子代,PCR结果显示全部只含有单标签插入,表明GS实验获得的高产后代并不是由于重组所导致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 链霉菌及其模式菌株天蓝色链霉菌的概述
• 1.2 转座及Tn5转座
• 1.3 链霉菌中的转座诱变
• 1.3.1 链霉菌的体内转座
• 1.3.2 链霉菌中的体外转座
• 1.4 天蓝色链霉菌中形态分化相关基因
• 1.4.1 光秃基因bld
• 1.4.2 白基因whi
• 1.5 天蓝色链霉菌A3（2）中次级代谢调控基因
• 1.5.1 途径特异性调控基因
• 1.5.2 多效性调控基因
• 1.6 本课题研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒与引物
• 2.3 培养基与生化试剂
• 2.4 DNA基本操作
• 2.4.1 大肠杆菌质粒的抽提
• 2.4.2 链霉菌总DNA的提取
• 2.4.3 DNA的连接
• 2.4.4 DNA片段凝胶回收（试剂盒回收）
• 2.4.5 Southern blot（DIG杂交）
• 2.4.6 大肠杆菌感受态制备及DNA转化
• 2.4.7 PCR技术
• 2.4.8 PCR-targeting中大肠杆菌电转化感受态的制备及电转化
• 2.5 链霉菌的基本遗传操作
• 2.5.1 大肠杆菌和链霉菌的接合转移
• 2.5.2 链霉菌原生质体制备
• 2.5.3 链霉菌原生质体融合
• 3 结果与分析
• 3.1 转座子载体构建及转座效率检测
• 3.1.1 IS493转座子载体pTn493A
• 3.1.2 Tn5转座子载体pHL654、pHL655、pHL656
• 3.1.3 不稳定复制型IS493转座子pTn493B、pTn493C、pTn493D
• 3.1.4 不稳定复制型Tn5转座子载体pHL661、pHL701
• 3.1.5 OE转座边界Tn5转座子载体pHL721、pHL722
• 3.1.6 Tn5p（5）转座酶Tn5转座子载体pHL724、pHL725
• 3.1.7 复制子在转座子内部的转座子载体pHL734
• 3.2 pHL724转座诱变构建天蓝色链霉菌A3（2）突变体库
• 3.2.1 突变体库构建及突变子表型筛选
• 3.2.2 突变子转座插入位点的测定
• 3.2.3 同一基因重复插入的突变体表型观察及基因功能分析
• 3.3 pHL734转座诱变构建天蓝色链霉菌A3（2）突变体库
• 3.3.1 突变体库构建及突变子表型筛选
• 3.3.2 1493株突变子的插入位点定位
• 3.3.3 Tn5转座插入靶位点分析
• 3.3.4 天蓝色链霉菌A3（2）自发突变率及转座突变子的稳定性
• 3.3.5 whi突变子的基因功能分析
• 3.3.6 blad突变子的基因功能分析
• 3.3.7 ACT产量升高突变子的基因功能分析
• 3.3.8 ACT产量降低突变子的基因功能分析
• 3.3.9 Red产量变化突变子的基因功能分析
• 3.3.10 重复插入同一基因的突变子表型比较
• 3.3.11 成簇突变基因功能分析
• 3.4 38株ACT高产突变子Genome shuffling
• 3.4.1 突变子原生质体制备及融合
• 3.4.2 融合子的PCR检测
• 3.4.3 融合子后代的遗传标签检测
• 3.4.4 ACT高产菌株及PCR分析
• 4 总结与展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢