炎症引起胆固醇敏感器SCAP功能失调致泡沫细胞形成的分子机制

论文摘要

目的细胞内胆固醇主要来源于两个方面,即外源性胆固醇摄入和内源性胆固醇合成,它们均通过一个依赖于细胞内胆固醇水平的反馈调节系统的严密控制来保证胆固醇的内稳态平衡,即主要通过SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路实现对细胞内脂质稳态平衡的调节。过去的研究中,我们已经证实炎症可以通过干扰胆固醇介导的LDLr负反馈调节来促进外周细胞,如血管平滑肌细胞（VSMCs）及肾小球系膜细胞（HMCs）的胆固醇摄入,同时下调ABCA1基因表达来减少胆固醇外流,从而导致胆固醇在外周细胞异常堆积形成泡沫细胞。本研究在过去研究的基础上,选用人THP-1巨噬细胞和VSMCs细胞,①探讨炎症是否干扰巨噬细胞内LDLr负反馈调控,从而导致巨噬细胞大量摄入天然LDL形成泡沫细胞;②探讨炎症导致VSMCs细胞内胆固醇敏感器SCAP从内质网异常逃逸到高尔基体的分子机制;③比较生理条件及炎症状态下,巨噬细胞和VSMCs细胞LDLr负反馈调控的差异。材料和方法用酶学法分别检测THP-1巨噬细胞和VSMCs细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）和胆固醇酯（CE）的水平;油红O染色观察细胞内脂质积聚情况;提取细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative PCR）检测LDLr、SREBP2、SCAP、α-mannosidaseⅡ、SR-A和CD36 mRNA水平;用Western blotting法检测LDLr、SREBP2和SCAP蛋白表达水平;用免疫细胞化学法检测α-mannosidaseⅡ蛋白表达水平;用抗人SCAP抗体和抗高尔基体抗体双重染色后,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞SCAP-SREBP2复合物在内质网和高尔基体的定位;用免疫荧光法检测巨噬细胞SR-A的蛋白表达;应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测两种细胞培养基中肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）水平;应用MTT法检测两种细胞在不同时间、不同浓度LPS刺激下的存活率。结果1.我们证实LPS通过LDLr增加天然LDL在巨噬细胞内积聚。进一步,我们研究了炎症状态下,调控LDLr表达的两个重要分子SCAP和SREBP2的表达和细胞内转位。实验证实LPS诱导的炎症反应增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表达,进而增大SCAP/Insig1比率,导致Insig1数量不足,不足以锁定SCAP-SREBP2复合物,造成SCAP-SREBP2复合物即使在胞内高浓度胆固醇水平下,仍从内质网逃逸到高尔基体。这种异常逃逸打破了LDLr的生理性负反馈调节,进而将THP-1巨噬细胞转变为泡沫细胞。2.我们的实验证实高尔基体α甘露糖苷酶Ⅱ（α-mannosidaseⅡ）特异性抑制剂苦马豆碱（swainsonine）能显著抑制VSMCs细胞SCAP的异常逃逸,减少SCAP-SREBP2复合物从内质网转位至高尔基体,同时抑制SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表达,最终减少LDLr表达和外源性胆固醇的摄入,逆转炎症诱导的泡沫细胞形成,提示SCAP异常糖基化修饰可能是炎症导致其在内质网与高尔基体间异常循环的机制之一。同时,我们也观察到苦马豆碱的抑制效应只在浓度为2.5和5μg/ml时出现,7.5μg/ml的苦马豆碱反而上调LDLr表达。苦马豆碱对α-mannosidaseⅡ特异性抑制,反馈性增加α-mannosidaseⅡmRNA和蛋白表达。3.生理情况下,巨噬细胞和VSMCs细胞负荷不同浓度LDL,两种细胞LDLr表达都显著减少,但VSMCs细胞LDLr的下调比巨噬细胞快,而且下调幅度更大,提示其“下调敏感”,可以迅速关闭LDLr,减少脂质摄取;当有LPS存在时,两种细胞LDLr表达均上调,但巨噬细胞LDLr被LPS上调的更快,幅度更大,提示其“上调易感”。同时,我们证实巨噬细胞SR-A水平表达远远高于单核细胞和VSMCs细胞。结论我们证实:炎症可以导致巨噬细胞通过LDLr途径大量摄入天然LDL,从而导致泡沫细胞形成,氧化LDL不是巨噬细胞泡沫化的唯一胆固醇来源,天然LDL同样可以致动脉粥样硬化,这可能是巨噬细胞泡沫样变的另一条通路;炎症可以增加高尔基体α-mannosidaseⅡ的活性,加强对SCAP的糖基化修饰,同时增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表达,促进SCAP从内质网异常逃逸到高尔基体,从而增加核转录因子SREBP2-N进入胞核,启动LDLr表达,增加胆固醇摄入,导致泡沫细胞形成;在生理情况下,加载LDL时,VSMCs细胞LDLr下调比巨噬细胞明显、下调幅度更大,在炎症刺激物LPS作用下,巨噬细胞LDLr上调迅速,而且上调幅度更大,提示炎症状态下巨噬细胞比VSMCs细胞更容易发生泡沫样改变。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文:炎症引起胆固醇敏感器SCAP功能失调致泡沫细胞形成的分子机制
• 前言
• 第一部分 炎症通过LDLr增加非修饰LDL摄取:巨噬细胞形成泡沫细胞的另一条通路
• 实验一 巨噬细胞培养及鉴定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 结论
• 实验二 炎症增加巨噬细胞非修饰LDL的摄取及LDLr表达失调的分子机制
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.结论
• 第二部分 炎症导致血管平滑肌细胞泡沫化的分子机制
• 实验一 LPS、LDL及苦马豆碱有效浓度的确定
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.结论
• 实验二 炎症状态下胆固醇敏感器SCAP从内质网异常逃逸到高尔基体的分子机制
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.结论
• 第三部分 巨噬细胞和血管平滑肌细胞在生理条件及炎症状态下LDLr反馈调节差异的比较研究
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.结论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文目录