黑曲霉β-甘露聚糖酶基因的克隆及其原核和真核表达

论文摘要

β–甘露聚糖酶（endo-1,4-β-D-mannanase;mannohydrolase;EC3.2.1.78）是一类能够水解甘露寡糖、甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等）中的1,4-β-D-甘露糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类。目前β–甘露聚糖酶己在食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物研究技术等多方面得到广泛运用,黑曲霉是工业化生产甘露聚糖酶的主要菌种,但是目前的生产菌种存在发酵过程中产生大量孢子、发酵周期短、发酵条件难以控制、酶产量低等缺点。利用基因工程方法构建甘露聚糖酶工程菌,简化发酵条件,增加酶的产量,具有重要的研究价值。本研究以甘露聚糖酶基因生产菌种黑曲霉为基因供体,克隆甘露聚糖酶基因（MAN）,构建其大肠杆菌表达载体、毕赤酵母表达载体和黑曲霉表达载体,并分别转到大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和糖化酶生产菌种黑曲霉中,为简化甘露聚糖酶的发酵条件,增加酶的产量探索新的途径。主要研究成果如下:1.MAN在大肠杆菌中的表达以β-甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料,通过RT-PCR扩增获得β-甘露聚糖酶基因MAN的cDNA片段。构建了MAN基因的大肠杆菌表达载体pET-MAN。酶切鉴定正确后,将该载体导入大肠杆菌BL21。重组菌株经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE,在菌体裂解物上清得到62 KD的融合蛋白条带,表明黑曲霉β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中表达成功。用DNS法的测定不同温度、不同pH下菌体裂解物上清中的甘露聚糖酶活性,结果表明重组甘露聚糖酶的最适温度为55℃,最适pH为5.5,在此的条件下,甘露聚糖酶活力为48 IU/mL。2.MAN基因在毕赤酵母中的表达以MAN的cDNA片段为模板,通过PCR扩增获得去除自身信号肽序列的MAN基因片段。构建了由GAP启动子调控、带有改造后的α信号肽序列的MAN基因毕赤酵母表达载体pGAPHα-MAN。酶切鉴定正确后,将载体线性化并通过电击转化毕赤酵母GS115。经PCR鉴定得到重组子。3.MAN基因在黑曲霉中的表达以β-甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料,通过PCR扩增获得β-甘露聚糖酶基因MAN的基因组序列。以糖化酶生产菌黑曲霉为材料,通过PCR扩增获得Gla基因5’和3’同源臂的DNA片段。通过重叠延伸PCR的方法将MAN,Gla5’,Gla3’三个片段连接在一起构成MAN基因同源重组表达框GMG。进一步构建了MAN基因黑曲霉表达载体pSZH-MAN。pSZH-MAN质粒通过冻融法转入农杆菌EHA105中,与糖化酶生产菌黑曲霉共培养。筛选转化子,获得重组甘露聚糖酶的工程菌。重组菌株经诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE,并用DNS法的测定该蛋白的甘露聚糖酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究的目的与意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 β-甘露聚糖酶
• 1.2.2 毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.2.3 丝状真菌表达系统研究进展
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 2 材料方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及载体
• 2.1.2 试剂及酶类
• 2.1.3 常用试剂的配制
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 黑曲霉RNA 的提取
• 2.2.2 RNA 的反转录
• 2.2.3 黑曲霉DNA 的提取
• 2.2.4 基因与同源臂的克隆
• 2.2.5 MAN 基因在大肠杆菌中的表达
• 2.2.6 MAN 基因在毕赤酵母中的表达
• 2.2.7 MAN 基因在黑曲霉中的表达
• 2.2.8 重组子的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 MAN 基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1.1 黑曲霉RNA 的提取
• 3.1.2 MAN 基因的克隆
• 3.1.3 MAN 基因大肠杆菌表达载体构建
• 3.1.4 重组菌株pET-MAN 的诱导表达
• 3.2 MAN 基因在毕赤酵母的表达
• 3.2.1 MAN 基因的扩增
• 3.2.2 酵母表达载体的构建
• 3.2.3 毕赤酵母的转化
• 3.2.4 重组菌株的表达
• 3.3 MAN 基因在黑曲霉中的表达
• 3.3.1 潮霉素B 筛选浓度的确定
• 3.3.2 MAN,Gla5,Gla3 基因的克隆
• 3.3.3 黑曲霉表达载体的构建
• 3.3.4 重组质粒转化农杆菌
• 3.3.5 MAN 重组菌株的筛选和鉴定
• 4 讨论
• 4.1 重叠延伸PCR 的应用
• 4.2 MAN 稀有密码子
• 4.3 遗传转化系统的选择
• 4.4 遗传转化系统的优化
• 5 结论
• 5.1 基因的扩增
• 5.2 甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达
• 5.3 甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达
• 5.4 甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文