间充质干细胞及成骨细胞对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及机制探讨

论文摘要

多发性骨髓瘤（Multiple myeloma ,MM）是浆细胞恶性增殖性疾病,其特点是恶性浆细胞在骨髓微环境中不规则积聚引起溶骨性骨破坏、肾功能损害、贫血、高钙血症和感染等临床表现,占血液科肿瘤的10%-15%左右。尽管在过去的几十年中有关MM发病机制、诊断和治疗的研究取得了较大的进展,但是仍然有许多重要的问题悬而未解。目前MM仍是一种不可治愈的血液系统恶性肿瘤,MM的发病机制复杂,近年主要集中在细胞遗传学异常、骨髓微环境与骨髓瘤细胞相互作用、NF-kB及Notch信号通路和耐药机制几方面。大量研究表明骨髓微环境在骨髓瘤细胞的生长、存活、耐药及归巢中起重要作用。【目的】:研究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）及成骨细胞（Osteoblasts, OBs）与MM细胞在体外共培养过程中,对MM细胞体外生长增殖、凋亡、自噬的影响,探讨骨髓微环境变化对MM细胞增殖、迁移及生物学行为的影响,为MM临床治疗提供新的理论依据和实验基础。【方法】:分离绿色荧光（GFP）小鼠长骨,冲出骨髓并接种于培养瓶,取第3代绿色荧光间充质干细胞,MTT法绘制细胞的生长曲线,流式细胞仪检测其细胞周期及表面标记物的表达,并用VonKossa试剂盒鉴定细胞的成骨分化能力。取第三代GFP-MSCs及成骨细胞株与IL-6依赖的人多发性骨髓瘤细胞株XG-7的共培养,通过PI法、Annexin V/PI双标记法及MDC（单丹磺酰尸胺）观察直接共培养、间接共培养（Transwell）前后XG-7细胞数量、细胞周期、凋亡、及自噬变化。我们以CD138分子标记XG-7,共聚焦显微镜动态检测XG-7与MSCs、OB直接接触后变化;加入胆固醇消耗剂甲基β环糊精破坏膜的完整性后,观察CD138标记的XG-7的变化。【结果】:分离培养的GFP-MSCs具有较强的增殖能力和较高的成骨细胞分化潜能,表型分析显示MSCs不表达CD34、CD45等造血细胞表面标志,低表达CD106,高表达CD29及间充质干细胞表面标志CD105等。GFP-MSCs及OBs与XG-7细胞直接和间接共培养后,促进MM细胞生长,其抗凋亡能力增强,处于S期的细胞较多,增殖活性强,共聚焦显微镜观察其抗无血清诱导自噬能力增强。共培养条件下,PE标记的CD138在MM细胞胞膜上呈现极化状态,其中多数XG-7细胞是以极化的胞膜区同OB或MSCs接触,加入甲基β环糊精破坏胞膜的流动性后,极化现象消失。【结论】:本实验成功的在体外建立一种简便可行的GFP-MSCs培养扩增方法,进而得到一种高表达绿色荧光的MSCs,且该绿色荧光蛋白不影响MSCs生物学功能,能够持久稳定表达,多次传代其荧光强度也无明显变化,是较为理想、方便、高效的示踪工具,为下一步研究造血干细胞移植的显微解剖关系带来了方便。MSCs及OBs增强XG-7细胞抗凋亡及抗自噬的能力,并可促进XG-7细胞的生长,对其生存增殖起到庇护作用;MM细胞可通过极化的粘附分子延长与骨髓基质细胞的接触时间,提示二类细胞密切接触是保护MM细胞免受凋亡诱导剂作用的重要基础,为进一步阐明MM发病机制、探索MM新的临床治疗靶点提供理论和实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 研究背景
• 第一部分 绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 第二部分 间充质干细胞及成骨细胞对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响及机制探讨
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• REFERENCES
• 中英文对照缩略词表
• 攻读硕士学位发表的文章
• 致谢