洋葱再生体系建立及原生质体分离条件的筛选

论文摘要

洋葱,百合科葱属蔬菜作物,是世界第四大的蔬菜作物,在我国广为栽培。洋葱栽培已有5000多年的历史,可谓历史悠久。由于洋葱是二、三年生异花授粉、异质性强、花器结构小、单株结籽少、自交2-3代后易发生退化、甚至失去育性等客观因素的存在,导致常规育种上一直存在育种周期长,育种效率低等问题,因而目前在我国洋葱生产上使用的品种大多数为国外品种,国内育成品种却是廖廖无几。而原生质体不仅可以进行病毒侵染机理等基础研究,还是遗传转化的理想受体,且原生质体融合还可以克服不同物种细胞间的不亲和障碍,为实现远源物种间的体细胞杂交、培育新种开辟了新的途径。本研究探讨了不同的外植体获得的洋葱再生体系的建立,利用获得的胚性愈伤组织作为材料进行原生质体分离,得到高产量的原生质体,探讨了原生质体分离培养的影响因素,旨在建立洋葱原生质体的再生培养体系,为以后导入一些优良的目的基因及原生质体融合等遗传操作,最终创造优良的种质资源奠定基础。本研究的主要结果如下：1、建立了洋葱无菌苗鳞茎盘再生体系：愈伤诱导最佳培养基为MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA1.0mg/L,出愈率都在90%以上；芽分化最佳培养基为NAA0.5mg/L+6-BA 1.Omg/L,芽分化率为81.67%。2、建立了洋葱花蕾再生培养体系：愈伤最佳诱导培养基为MS+2,4-D2mg/L+6-BA4mg/L,花蕾出愈率38.33%,平均愈伤率63.83%,直接芽诱导率为3%,均为各组合最高值；芽分化最佳培养基为6-BA 2.0mg/L+NAA 1.Omg/L,诱导率可得77.88%。3、选用甘露醇为渗透压稳定剂,确定了洋葱愈伤的渗透压为0.6mol/L。4、建立了洋葱愈伤原生质体快速分离体系：（1）以愈伤组织为游离材料的的最佳酶液组合为0.6M甘露醇+0.1%MES+2.0% Cellulase Onozuka R-10+0.1%PectolyaseY-23+0.5%Macerozyme R-10,溶于CPW溶液中,pH为5.8,在25℃黑暗条件下,酶解5-6h为最佳。筛选条件时,离心600转/min,培养12d的愈伤材料为最佳条件。（2）原生质体培养初步研究发现：洋葱悬愈伤分离得到的原生质体,采用固液双层培养法和液体浅层培养法,在培养密度为1×105个/mL时,在MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+O.1％水解酪蛋白+0.2mol/L葡萄糖+0.2mol/L蔗糖+0.6mol/L甘露醇,培养基上观察到长壁的原生质体,只有观察到第一次分裂,以后就没有更进一步的发现。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 引言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 本研究的目的和意义
• 2 研究综述
• 2.1 葱蒜类组织培养
• 2.1.1 茎尖培养
• 2.1.2 叶片培养
• 2.1.3 花器官培养
• 2.1.4 茎盘培养和鳞茎培养
• 2.1.5 胚培养
• 2.1.6 单倍体诱导和试管受精
• 2.1.7 葱蒜类植物组织培养存在的问题及展望
• 2.1.7.1 培养过程中体细胞染色体变异性强的控制
• 2.1.7.2 研究展望
• 2.2 植物原生质体培养和融合
• 2.2.2 葱蒜类植物原生质体培养和融合
• 2.2.2.1 葱蒜类植物原生质体研究进展
• 2.2.2.2 影响原生质体产量和活力的因素
• 2.2.2.2.1 基因型
• 2.2.2.2.2 起始材料
• 2.2.2.2.3 酶种类、酶浓度和酶解时间
• 2.2.2.2.4 甘露醇浓度
• 2.2.2.3 影响原生质体培养的因素
• 3 材料与方法
• 3.1 再生体系建立
• 3.1.1 不同外植体的获得
• 3.1.2 培养条件
• 3.1.3 激素配方的设计
• 3.2 原生质体培养初探
• 3.2.1 愈伤组织的获得
• 3.2.2 原生质体的分离
• 3.2.3 原生质的纯化
• 3.2.4 原生质体产量及活力测定
• 3.2.4.1 原生质体产量测定
• 3.2.4.2 原生质体活力测定
• 3.2.5 原生质体融合与培养
• 4 结果与分析
• 4.1 再生体系建立
• 4.1.1 无菌苗再生体系建立
• 4.1.1.1 外植体的筛选
• 4.1.1.1.1 不同激素配比对愈伤诱导的影响
• 4.1.1.2 洋葱鳞茎盘愈伤组织的分化培养
• 4.1.1.2.1 不同激素配比对鳞茎盘愈伤组织分化的影响
• 4.1.2 洋葱幼蕾培养再生体系
• 4.1.2.1 洋葱幼蕾愈伤组织的获得
• 4.1.2.1.1 不同激素浓度配比对花蕾诱导愈伤组织的影响
• 4.1.2.2 不同植物激素对花蕾愈伤组织分化的影响
• 4.1.2.3 不定芽的生长与生根情况
• 4.1.2.4 再生植株的驯化移栽
• 4.2 洋葱原生质体培养初探
• 4.2.1 不同酶液配比对原生质体产量和活力的影响
• 4.2.2 酶解时间对原生质体产量和活力的影响
• 4.2.3 混合酶液中甘露醇浓度对原生质体产量和活力的影响
• 4.2.4 离心速度对洋葱原生质体分离的影响
• 4.2.5 不同愈伤组织继代时间对原生质体分离的影响
• 4.2.6 原生质体的培养
• 5 讨论
• 5.1 不同洋葱外植体愈伤组织的诱导
• 5.2 玻璃化现象
• 5.3 影响原生质体分离过程中产量和活力的因素
• 5.3.1 酶解材料的选择
• 5.3.2 酶的种类和组合
• 5.3.3 甘露醇浓度
• 5.4 洋葱原生质体培养
• 参考文献
• 致谢
• 插图
• 附录