PCF经ROS/UCP2/cytoC信号通路对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的调控

论文摘要

目的复制8J·cm-2UVA辐射损伤HaCaT角质形成细胞的凋亡模型,探究线粒体解偶联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）在UVA诱导的HaCaT细胞凋亡中的调控作用,确定线粒体解偶联蛋白2对活性氧的调控,从线粒体呼吸链复合酶、活性氧（ROS）、线粒体解偶联蛋白2（UCP2）、细胞色素C（cytoC）、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)的角度,研究扇贝多肽（polypeptide from Chlamys farreri, PCF）保护UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法复制8J·cm-2 UVA照射HaCaT细胞后18h的最佳凋亡模型,实验设计分为:对照组、UVA模型组、PCF组(5.69, 2.84, 1.42 mmol·L-1PCF)、抑制剂组(5mmol·L-1 NAC)。采用琼脂糖凝胶电泳法和Hochest 33258荧光染色观察UVA引起的细胞凋亡形态学变化及细胞凋亡率;2,7-二氯氢化荧光素二酯荧光探针,检测PCF对UVA损伤细胞后ROS生成量的影响; RT-PCR检测胞浆谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT） mRNA的表达;免疫印迹法检测胞浆超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）, UCP2,凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic peptidase activating factor 1, Apaf-1),细胞色素C（cytoC）的蛋白表达;用紫外分光光度法测定呼吸链复合酶I（NADH∶Q还原酶）的活性。结果UVA模型组HaCaT细胞出现明显的凋亡梯形条,细胞核发生明显固缩,PCF组梯形条带明显减少同时还提高了Cu,Zn-SOD、GPx和CAT的表达（P<0.05）;UVA辐射HaCaT细胞后18h凋亡模型细胞中的ROS含量明显升高;1.42-5.69 mmol·L-1剂量范围内的PCF可明显抑制UVA引起的细胞内活性氧的产生（P<0.05）;UVA模型组中UCP2的表达明显增高而正常对照组及预先加入NAC活性氧清除剂的细胞中UCP2几乎不表达,1.42-5.69 mmol·L-1剂量范围内的PCF可剂量依赖性提高UCP2的蛋白表达（P<0.05）;UVA模型组cytoC向胞浆的释放量明显增多,Apaf-1表达量升高（P<0.05）1.42-5.69 mmol·L-1剂量范围内的PCF可明显抑制cytoC向胞浆释放（P<0.05）及Apaf-1蛋白的表达（P<0.05）;UVA模型组呼吸连复合酶I的活性明显下降PCF组可以剂量依赖性提高复合酶的活性抑制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡（P<0.05）。结论PCF可以通过提高细胞内的过氧化物酶（Cu,Zn-SOD、GPx和CAT）的表达抑制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡线粒体解耦蛋白2参与了UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的调控机制,UVA辐射损伤HaCaT细胞,细胞中会产生大量的ROS,ROS可以激活UCP2的表达,PCF可以经ROS/UCP2/cytoC这一信号通路抑制8J·cm-2UVA辐射诱导的HaCaT细胞凋亡,并在1.42-5.69 mmol·L-1剂量范围内呈剂量依赖性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 UVA 诱导HaCaT 细胞凋亡的研究现状
• 0.1.1 线粒体解偶联蛋白2 对紫外线诱导的细胞凋亡的影响
• 0.2 线粒体解偶联蛋白2 的简介
• 0.2.1 线粒体解偶联蛋白2 的分子结构
• 0.2.2 线粒体解偶联蛋白2 的组织分布
• 0.3 细胞凋亡的线粒体通路的激活
• 0.3.1 凋亡相关因子的向胞浆的释放与调节
• 0.4 线粒体解偶联蛋白2 对细胞凋亡的调控作用
• 0.4.1 活性氧的产生与调控
• 0.4.1.1 UCP2 通过调控ROS 的产生来抑制细胞凋亡
• 0.4.1.2 ROS 对UCP2 的反馈调控
• 0.4.2 UCP2 与Bcl-2 家族结合影响细胞凋亡
• 0.5 本文的研究内容及意义
• 1 HaCaT 细胞培养
• 1.1 实验材料、仪器及试剂
• 1.1.1 HaCaT 细胞
• 1.1.2 培养基及常用溶液
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 HaCaT 细胞的复苏
• 1.2.2 HaCaT 细胞的传代
• 1.2.3 HaCaT 细胞的冻存
• 1.3 实验结果
• 2 UVA 诱导 HaCaT 细胞凋亡模型的复制及 PCF 对凋亡的影响
• 2.1 实验材料、仪器及试剂
• 2.1.1 细胞及药物来源
• 2.1.1.1 细胞株
• 2.1.1.2 扇贝多肽
• 2.1.2 培养基及溶液
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 3 PCF 经 ROS/UCP2/cytoC/Apaf-1/caspase-3 信号通路抑制 UVA 诱导的 HaCaT 细胞凋亡
• 3.1 实验材料、仪器及试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 细胞株、培养基
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PCF 对 UVA 诱导的 HaCaT 细胞中 ROS 水平的影响
• 3.2.2 PCF 对 UCP2/cytoC/Apaf-1 蛋白表达的影响
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 PCF 对 UVA 诱导的 HaCaT 细胞中 ROS 水平的影响
• 3.3.2 PCF 对 UCP2/cytoC/Apaf-1 蛋白表达的影响
• 3.4 讨论
• 4 PCF 经线粒体呼吸链调控 UVA 诱导的 HaCaT 细胞凋亡
• 4.1 实验材料、仪器及试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 细胞株、培养基
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 中英文缩略词对照表
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文