酸马奶酒中微生物的分离鉴定及抗菌因子的研究

论文摘要

本研究对内蒙古锡盟地区酸马奶酒中的微生物进行分离鉴定,对部分菌株进行了DNA序列同源性分析,同时对酸马奶酒中来自于乳酸菌、酵母菌及其它成分的抗菌因子进行了研究,为探讨酸马奶酒的医疗价值及其作用机理提供依据。从15份酸马奶酒中共分离到47株乳酸菌、19株酵母菌,采用传统的形态学和生理生化方法鉴定,结果表明乳酸菌中26株为杆菌,属于Lactobacillus的九个种,一株未归种;21株为球菌,属于Enterococcus、Lactococcus、Leuconostoc三个属中的六个种。19株酵母菌中有18株分别归属为Endomyce,Lodderomyces,Pichia,Torulaspora,Kloeckera,Saccharomycodes,Saccharomyces,Brettanomyces,Pachytichospora九个属,有1株未能归属。选取两株乳酸球菌进行了分子生物学鉴定,根据16S rDNA序列同源性分析,菌株BY-3-2鉴定为E.faecium ,菌株SQ-3-2鉴定为E.durans。选取一株酵母菌HJ-5进行分子生物学鉴定,通过26S rDNA D1/D2序列分析,被鉴定为Saccharomyces cerevisiae。分子生物学鉴定与形态和生理生化鉴定结果相一致。对已分离鉴定的47株乳酸菌进行了产抑菌物质菌株的筛选,筛选出两株抑菌活性较强的BY-3-2和SQ-3-2球菌进行了生物学特性、抑菌动力学及其抑菌稳定性研究,并对抗菌因子进行分离提纯及其特性研究。结果表明,菌株BY-3-2最适生长温度为37℃,最低pH值为4.41,在发酵8h后产生抑菌物质,12 h达到高峰;其发酵液经50%硫酸铵溶液可沉淀抑菌活性物质,经CM-52离子交换层析和凝胶G-100层析分离,得到有活性的物质。电泳后呈现三条电泳带,为混合蛋白质,分子量在33,800Da～42,800Da之间。该物质在pH值4.0和6.0时抑菌活性高,有一定的耐热性,对淀粉酶、蛋白酶比较敏感。菌株SQ-3-2最适生长温度为30℃,最低pH值为3.78,抑菌活性物质出现的高峰在发酵的第13 h。其发酵液经70%硫酸铵溶液沉淀,采用同样的方法两次过柱纯化仍然得到有活性的物质是一混合蛋白,电泳后呈两条电泳带,分子量为22,700Da和23,200Da。该物质在低pH范围内抑菌活性高,耐热性差,60℃以上加热失活,对淀粉酶、蛋白酶相对不敏感。通过高温、化学物质、温度结合化学物质损伤处理后,两株乳酸菌的抑菌活性都没有发生明显变化（P>0.05）,说明两株菌的抑菌特性稳定。控制发酵液的pH值为6.5,可以提高两株菌抑菌物质的产率和活性。通过培养基的优化也可以提高抑菌物质的产率。同样对已分离鉴定的19株酵母菌进行了产抑菌物质菌株的筛选,选出一株抑菌活性较强的HJ-5菌株进行了抗菌特性研究和抗菌因子的分离提纯及初步鉴别。HJ-5菌株最适生长温度为26～28℃,发酵6 h以后开始产抑菌物质,42 h后达到高峰。其发酵上清液超滤后,分子量范围在Mr<30kDa的超滤液抑菌活性最强;在pH2和8条件下用多种有机溶剂进行提取,乙醚提取效果最好,粗提液的抑菌活性提高1.38倍。经捷克八溶剂法鉴别和离子特性鉴别,HJ-5抑菌物质不属于已知的六大类抗生素,是一种中性物质。该抑菌物质在pH 7以下活性较强,随着pH值升高活性明显降低;pH值越低,耐热性越强,在pH为2,121℃的高温条件下,20 min仍具有一定的抑菌活性。通过对酸马奶酒中的抗结核菌因子研究表明,酸马奶酒中的粗脂肪,特别是脂肪的中性萃取物有较强的抑制结核菌作用;此外酸马奶酒中酵母菌对结核菌也有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 酸马奶酒的起源、研究现状
• 1.1.1.1 酸马奶酒的史话
• 1.1.1.2 酸马奶酒的制作方法
• 1.1.1.3 马奶的营养及医疗价值
• 1.1.1.4 酸马奶酒的营养与医疗价值
• 1.1.1.5 酸马奶酒中微生物的研究
• 1.1.2 乳酸菌的研究进展
• 1.1.2.1 乳酸菌的分类研究
• 1.1.2.2 乳酸菌的生理功能及其应用
• 1.1.2.3 乳酸菌细菌素的研究概况
• 1.1.3 酵母菌的研究进展
• 1.1.3.1 酵母菌的分类研究
• 1.1.3.2 酵母菌在食品工业中的应用
• 1.1.3.3 酵母菌产生抑菌物质的研究进展
• 1.2 课题研究的目的和意义
• 1.2.1 课题研究的背景及其意义
• 1.2.2 主要研究内容与技术路线
• 2 酸马奶酒中微生物的分离鉴定及基因序列同源性分析
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 标准菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.3.1 乳酸菌鉴定培养基
• 2.1.3.2 酵母菌鉴定培养基
• 2.1.4 化学试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 乳酸菌的分离鉴定及165 rDNA 序列同源性分析方法
• 2.2.1.1 乳酸菌的分离、纯化与保存
• 2.2.1.2 乳酸菌分离株的形态及生理生化鉴定
• 2.2.1.3 两株乳酸菌165 rDNA 序列测定及同源性分析
• 2.2.2 酵母菌的分离鉴定及265 rDNA D1/D2 序列同原性分析方法
• 2.2.2.1 酵母菌的分离、纯化
• 2.2.2.2 酵母菌的形态与生理学特征鉴定
• 2.2.2.3 酵母菌265 rDNA D1/D2 序列测定及同源性分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 乳酸菌的分离鉴定及165 rDNA 序列同源性分析结果
• 2.3.1.1 乳酸菌分离株的菌落形态及细胞形态特征
• 2.3.1.2 乳酸菌分离株生理生化鉴定结果
• 2.3.1.3 乳酸菌165 rDNA 序列同源性分析结果
• 2.3.2 酵母菌的分离鉴定及265 rDNA D1/D2 序列同原性分析结果
• 2.3.2.1 酵母菌形态与生理特性
• 2.3.2.2 酵母菌265 rDNA D1/D2 序列同源性分析结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 3 酸马奶酒中抗菌因子的研究
• 3.1 酸马奶酒中乳酸菌抗菌因子的研究
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.1.1 菌株
• 3.1.1.2 培养基
• 3.1.1.3 化学试剂
• 3.1.1.4 仪器设备
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 产抑菌活性物质的乳酸菌筛选
• 3.1.2.2 两株产抑菌物质菌株发酵动力学研究
• 3.1.2.3 产抑菌物质菌株培养基的优化改进
• 3.1.2.4 抑菌物质的提取与纯化
• 3.1.2.5 抑菌物质粗品的理化特性研究
• 3.1.2.6 乳酸菌抑菌特性稳定性的研究
• 3.1.3 结果与分析
• 3.1.3.1 产抑菌活性物质的乳酸菌筛选结果
• 3.1.3.2 产抑菌物质菌株的发酵特性
• 3.1.3.3 产抑菌物质菌株培养基的优化改进结果
• 3.1.3.4 抑菌物质的分离与纯化
• 3.1.3.5 抑菌物质理化特性的研究
• 3.1.3.6 乳酸菌抑菌稳定性的研究
• 3.1.4 讨论
• 3.1.5 小结
• 3.2 酸马奶酒中酵母菌抗菌因子的研究
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 产抑菌活性物质酵母菌的筛选
• 3.2.2.2 培养条件对抑菌物质产生的影响
• 3.2.2.3 抑菌活性物质的分离提取
• 3.2.2.4 抑菌活性物质的初步鉴别
• 3.2.2.5 抑菌活性物质粗品的理化特性研究
• 3.2.3 结果与分析
• 3.2.3.1 产抑菌活性物质酵母菌的筛选结果
• 3.2.3.2 培养条件对抑菌物质产生的影响
• 3.2.3.3 抑菌活性物质分离提取
• 3.2.3.4 抑菌活性物质的初步鉴别结果
• 3.2.3.5 抑菌活性物质粗品的理化特性
• 3.2.4 讨论
• 3.2.5 小结
• 3.3 酸马奶酒中抗结核杆菌因子的研究
• 3.3.1 材料与方法
• 3.3.2 结果与分析
• 3.3.2.1 酵母菌对结核杆菌的抑制作用
• 3.3.2.2 酸马奶酒各组分对结核杆菌的抑制作用
• 3.3.2.3 酸马奶酒脂肪各组分对结核杆菌的抑制作用
• 3.3.3 小结
• 4 总体讨论与主要结论
• 4.1 总体讨论
• 4.2 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 作者简介